Mikroorganismu gēnu inženierija

1. Mikroorganismu gēnu inženierija 6. lekcija 2013./2014. mācību gada 2. semestris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

2. Ģenētiskā materiāla pārnese baktērijās"gēnu inženierija" dabā Var izdalīt trīs galvenos mehānismus, kādā veidā baktērijas var iegūst jaunu ģenētisko informāciju: Transformācija, (lat. transformatio – pārveidošana) - DNS iegūšana no apkārtējās vides. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

3. Ģenētiskā materiāla pārnese baktērijās Konjugācija, (lat. coniugatio – apvienojums) - DNS iegūšana tieši no citas baktērijas. Transdukcija (lat. transductio – pārvietošana) – citas baktērijas DNS iegūšana ar baktēriju vīrusu (bakteriofāgu) palīdzību. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

4. Transformācija DNS var būt dažāda izcelsme, bet visbiežāk tā ir palikusi pēc kādas citas baktērijas bojāejas. Pirmais baktēriju transformācijas efektu 1928. gadā aprakstīja Freds Griffits. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

5. Transformācija Tajā laikā bija zināms, ka viens no plaušu karsoņa (pneimonijas) izraisītājiem ir Streptococcus pneumoniae, kurš, izolēts no slimniekiem veido gludas (S) kolonijas, tomēr starp tām gadījās atrast arī mazākas, matētas kolonijas (R), kurās esošie mikroorganismi eksperimenta dzīvniekos slimību nespēja radīt. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

6. Transformācija R S S Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

7. Transformācija S S + R S Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

8. Transformācija Grifita eksperiments: liecināja, ka nonāvētās S baktērijas ir spējušas transformēt dzīvās R tipa baktērijas par S tipa baktērijām. Šis atklājums bija par pamatu tālākiem eksperimentiem, lai 1944. gadā pierādītu ģenētiskās informācijas nesēja ķīmisko dabu - tās ir DNS molekulas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

9. GI priekšvēsture 1944. gadā O.T. Avery, C.M. MacLeod un M. McCarty pierāda, ka DNS ir šūnas ģenētiskais materiāls. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

10. Transformācija Transformācija: Uzņemtie DNS fragmenti piedalās rekombinācijā ar genomisko DNS, kā rezultātā var notikt gēnu konversija, jaunu pazīmju parādīšanās. Transformācijas ceļā parasti tiek uzņemtas arī plazmīdas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

11. Konjugācija 1946 g. atklājuši Lederbergs un Tatums (Lederberg;Tatum) 1958 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

12. Konjugācija DNS pārnese no vienas baktērijas uz otru, kam nepieciešams fizisks kontakts starp abām baktērijām. To nodrošina proteīnu veidota mikrocaurulīte, kuru sauc par F vai dzimuma (Sex) pilu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

13. Konjugācija Lai konjugācija varētu notikt, nepieciešamas divu dažādu tipu baktērijas: "F+" un "F-". Šo atšķirību nosaka fertilitātes (F) faktora klātiene F+ šūnās. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

14. Konjugācija F faktors ir aptuveni 95 Kbp liela plazmīda (episoma, ja nav integrēta baktērijas genomā) ar 25 gēniem kas saimniekšūnai dod spēju konjugēt ar "F-" baktēriju. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

15. Konjugācija Vispirmstra operona gēni sintezē proteīnus, lai izveidotu F pilu, tad pie Ori secības tiek izveidots vienas fosfodiestersaites pārrāvums un sākas DNS replikācija. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

16. Konjugācija Jaunsintezētais DNS pavediens aizstāj veco, kurš tiek transportēts uz recipientšūnu. Replikācija notiek pēc slīdošā apļa principa. Transportējamajam pavedienam šajā laikā tiek uzsintezēts komplementārais DNS pavediens. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

17. Konjugācija Nonākot recipient-šūnā DNS atkal cirkularizējas. Pateicoties rekombinācijām starp IS (insertion sequence) elementiem, var notikt F plazmīdas integrācija baktērijas hromosomā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

18. F plazmīda Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

19. Konjugācija Visbiežāk konjugācijas laikā tiek pārnests pats F faktors, to sauc par F konjugāciju Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

20. Konjugācija Hfr konjugācija F faktors var integrēties baktērijas genoma vietās, kur atrodas homoloģiski IS elementi. E. coli genomā zināmas 19 F plazmīdas biežāk izmantotās insercijas vietas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

21. Konjugācija Hfr konjugācija Ja tas ir noticis, šādas šūnas sauc par Hfr (biežas rekombinācijas - high frequency recombination) šūnām. Tās ir gatavas veikt konjugāciju ar “F-” baktērijām. Tomēr recipienta šūna parasti nekļūst Hfr vai “F+”. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

22. Konjugācija Hfr konjugācija Konjugācijas laikā Hfr šūnas cenšas savu genomisko DNS pārnest “F-” šūnai, pārnese sākas ar genomisko DNS un kā pēdējais tiek pārnests F plazmīdas posms. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

23. Konjugācija Hfr konjugācija Parasti netiek pārnesta visa genomiskā DNS, jo F pili ir trausli un pārneses laikā var pārlūzt. Ar to arī konjugācija beidzas. Starp recipient-šūnu un saņemto DNS notiek daudzas rekombinācijas, jo abas DNS secības ir izteikti homologas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

24. Konjugācija F’ konjugācija F faktors var izšķelties no Hfr hromosomas, atkal veidojot cirkulāru plazmīdu episomas formā. Hfr baktērija kļūst par F+ baktēriju. F faktora izšķelšanās var notikt neprecīzi, šajā gadījumā F faktora DNS paņem līdzi nelielu fragmentu no baktērijas genomiskās DNS. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

25. Konjugācija F’ konjugācija Baktērijas genoma posmu saturošu F plazmīdu apzīmē kā F’ faktoru (plazmīdu). Ja šāda baktērija piedalās konjugācijas procesā, tiek pārnests arī neliels fragments no baktērijas hromosomas DNS. Tā rezultātā recipien-tšūna kļūst par F’ šūnu, pie kam tās genomā viens vai daži gēni ieguvuši diploidālu statusu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

26. Konjugācija F’ konjugācija Šādas daļēji diploidālas šūnas sauc par merozigotām. Tās daudz biežāk pāriet Hfr formā, jo F’ plazmīdai ir posms, kurš izteikti homologs recipienta hromosomai. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

27. Konjugācija Baktēriju genoma kartēšana Noder Hfr konjugācijas process. Tiek izvēlēta “F-” baktēriju līnija ar noteiktām mutācijām noteiktos gēnos (a-un b-utt.) un Hfr baktērijas, kurām šie gēni darbojas normāli (a+un b+utt.) . Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

28. Konjugācija Kartēšana Ja abi šie gēni konjugācijas laikā tikuši pārnesti, notiek recipient-šūnas konversija no a-, b- uz a+, b+ fenotipu. Ja pirms konjugācijas pārtrūkšanas ticis pārnests tikai a gēns, recipientšūnai būs fenotips a+, b-. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

29. Konjugācija Kartēšana Tādā veidā distanci starp gēniem var mērīt konjugācijas laika vienībās (minūtēs). Visa E. coli genoma pārnešani nepieciešamas 90 minūtes. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

30. Konjugācija Kartēšana BA Hfr F- Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

31. Konjugācija Kartēšana Ja noteikts, ka a gēna konversija (pārnese) notikusi pēc 5 minūtēm, bet b gēna – pēc 15 minūtēm, tas nozīmē, ka "attālums" starp abiem gēniem ir 10 konjugācijas minūtes. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

32. Ģenētiskā karte E. coli Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

33. Transdukcija DNS apmaiņa starp baktērijām ar baktēriju vīrusu (bakteriofāgu) palīdzību. Var izdalīt: - vispārēju transdukciju un - specifisku transdukciju. Abas atšķiras ar norises mehānismu un pārnesto DNS. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

34. Transdukcija Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

35. Transdukcija Vispārējā Daudzi bakteriofāgi infekcijas laikā inducē nukleāžu sintēzi. Tās noārda baktērijas hromosomu. Var gadīties, ka bakteriofāga apvalkā tiek iepakoti fragmenti no baktērijas genoma. Nepareizi pildītā vīrusa daļiņa pārnes nevis savu bet baktērijas DNS. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

36. Transdukcija Specifiskā Iespējama tikai ar noteiktu veidu bakteriofāgiem, (l fāgiem), kuru DNS integrējas saimniekšūnas hromosomas, noteiktās vietās. Izšķeļot savu DNS, vīruss var paņemt līdzi arī gabalu no baktērijas genomiskās DNS, kura atradusies ap vīrusa integrācijas vietu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

37. Transdukcija Specifiskā Jaunas infekcijas gadījumā baktērija saņem papildus DNS, kas var rekombinēt un radīt gēnu konversiju. Šie vīrusi integrējas baktērijas genomā tikai stingri noteiktās vietās, ar tiem pārnestie genoma fragmenti būs vieni un tie paši - tādi, kuri atrodas ap vīrusa DNS integrēšanās punktiem. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

38. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

39. DNS klonēšana Var klonēt ne tikai veselus organismus, bet arī - DNS fragmentus vai - noteiktus gēnus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

40. Kāpēc klonēt DNS ? To dara lai: - sadalītu kompleksus DNS fragmentu maisījumus, - atrastu vajadzīgo genoma daļu vai gēnu, - pavairotu vajadzīgo DNS fragmentu, - veiktu genomu sekvenēšanu, - veiktu gēnu aktivitātes, regulācijas pētījumus, Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

41. Kāpēc klonēt DNS ? To dara lai: - iegūtu nepieciešamu RNS, - iegūtu vajadzīgu proteīnu, - konstruētu kādu jaunu, dabā neesošu gēnu (RNS), - konstruētu kādu jaunu, dabā neesošu proteīnu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

42. Kāpēc klonēt DNS ? Lai sadalītu kompleksus DNS fragmentu maisījumus, organismu genomus un atrastu vajadzīgo daļu, bieži nākas veidot DNS bibliotēku. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

43. DNS bibliotēka DNS Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

44. DNS Bibliotēka Tā var izpausties kā: kāda organisma pilna genoma bibliotēka, speciālas genoma daļas bibliotēka, piemēram, - STS vai EST bibliotēka, - kādas DNS atkārtojumu grupas bibliotēka, - vispārēja kDNS (cDNS) bibliotēka, - kādiem audiem specifiska kDNS (cDNS) bibliotēka. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

45. Bibliotēkā ietilpst liels skaits rekombinanto klonu ar atšķirīgiem DNS insertriem DNS vektoros. Ideālā gadījumā bibliotēkas DNS kloniem būtu jāietver visi iespējamie insertu varianti vismaz vienā atkārtojumā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

46. GI eksperimentu shēma Klonēšanas eksperimenta shēmu un izmantojamos materiālus nosaka: - mērķis, kuru vēlas sasniegt un - paredzamais rezultāta pielietojums. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

47. GI eksperimentu shēma Klonēšanai nepieciešams: • klonējamā DNS; • vektors, kurā klonēt; • saimniekšūna, kurā ievadīt un pavairot rekombinanto molekulu Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

48. GI eksperimentu shēma Klonējamā DNS parasti nav spējīga sevi reproducēt, tādēļ tai nepieciešams vektors, - neatkarīgi replicēties spējīga molekula (replikons) un - saimniekšūna, kurā notiek attiecīgā vektora replikācija. Mūsdienu GI eksperimentos klonējamos DNS fragmentus baktēriju genomā parasti neievieto. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

49. GI eksperimentu shēma Vispārīgā gadījumā ar vektoru apzīmē vajadzīgā DNS fragmenta nesēju. Eikariotu GI gadījumā tas var būt rekombinants vīruss ar visiem apvalku slāņiem, liposoma u.c. lai DNS varētu nogādāt līdz vajadzīgā tipa šūnas citoplazmai vai kodolam. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš

50. Vektora izvēle un sagatavošana Insertējamās DNS ieguve un sagatavošana Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M. Lazdiņš