Enzymové a jiné markery využívané v diagnostice vybraných patologických stavů

1. Enzymové a jiné markery využívané v diagnostice vybraných patologických stavů

2. Cíle laboratorního vyšetření pomocí diagnostických markerů • laboratorní vyšetření informuje o probíhajících procesech v organizmu • fyziologických i patologických • změny laboratorních hodnot často předchází klinicky manifestní změny • subklinické, latentní stadium • cca 70-80% rozhodování zdravotnických profesionálů je opřeno o lab. vyšetření • cíle • (1) konstatování fyziologické situace (tj. zdraví) = prevence • (2) diagnóza choroby • (3) určení stadia • (4) odhad průběhu • (5) monitorování úspěšnosti terapie • (6) odhalení recidiv

3. Typy laboratorních vyšetření • z hlediska dostupnosti • základní – ve všech zdrav. zařízeních • specializovaná – spec. referenční centra • vysoce specializovaná • nejsou běžně indikována • ekonomická náročnost • netriviální interpretace nálezů • z hlediska požadavků na rychlost • rutinní • statimová • výsledek cca do 60 min od dodání do laboratoře • vitální indikace • výsledek cca do 30 min od dodání do laboratoře • kontinuální monitorování u lůžka či v ambulanci • např. ABR, oxygenace, glykemie, …

4. Obecné charakteristiky laboratorních metod • stanovení jednotlivých analytů může být prováděno různými metodami s různou výpovědní hodnotou • analytická spolehlivost metody • dána přístroj. vybavením, kalibrací, kvalifikace personálu aj. • parametry • správnost = odchylka od skutečné hodnoty (kombinace náhodných a systematických vlivů) • přesnost • opakovatelnost (stejná metoda, laboratoř, pracovník, krátký časový úsek) • reprodukovatelnost (stejná metoda, jiný pracovník, dlouhý časový úsek) • robustnost = rezistence vůči malým vlivům • tj. spolehlivost při běžném používání • selektivita = schopnost rozlišovat mezi měřeným analytem a ostatními přítomnými ve vzorku • citlivost = nejmenší rozdíl který může být zachycen

5. Validita metody / testu • analytická spolehlivost je předpokladem validity metody • tzn. vypovídací hodnoty • v praktické medicíně je to hranice, od které můžeme považovat změny koncentrace analytu za pozitivní nález • ale většinou dochází k překryvu mezi zdravými a nemocnými • skupina zdravých s falešně pozitivním testem (falešná pozitivita) • skupina nemocných s negativním testem (falešná negativita)

6. Validita metody / testu

7. Specificita vs. senzitivita metody

8. Referenční interval • raději než normální interval (co je normální?) se volí referenční interval hodnot u jasně definované referenční skupiny osob • co je referenční skupina? • zdraví, nebo spíše osoby bez takového zdrav, stavu, který přímo ovlivňuje / interferuje s měřenou veličinou • stanovení • historicky: x  2 SD • tj. 95% normálně rozložených hodnot • vlivy, které mohou ovlivňovat distribuci • věk, pohlaví, rasa, dieta, … • hodnoty mimo referenční interval • statistická/metodologická variabilita • biologická variabilita • 5% zdravé populace mimo

9. Laboratorní vyšetření - fáze • preanalytická • příprava nemocného na odběr, odběr, uchování, transport do laboratoře • až 60% chyb vznikne zde • faktory ovlivňující preanalytickou fázi • biologické (lačnění, věk, hmotnost, gravidita, kouření, pohlaví, rasa, zátěž, biologické rytmy, alkohol, léky a drogy, …) • odběr (chybná identifikace vzorku, výběr stabilizačního a antikoagulačního (EDTA, heparin, citrát, oxalát) činidla, poloha pacienta, délka zaškrcení, nesprávný odběr z kanyly, hemolýza, špatná technika odběru moče, …) • transport (doba do separace/centrifugace, teplota, osvětlení (bilirubin), …) • analytická • laboratoř musí pracovat v souladu se „správnou laboratorní praxí“ • systém vnitřní kontroly (denní kontrola referenčních vzorků) – nutné pro uvolnění výsledku • zapojení do systému externí kvality kontroly – nezávislou organizací, nutné pro akreditaci (ISO) /certifikaci laboratoře • postanalytická • interpretace výsledků (referenční hodnoty a časová dynamika změn)

10. Diagnostické markery • cirkulující • ionty • Na, K, Cl, … • metabolity • glukóza, cholesterol, TG, … • odpadní produkty • urea, kreatinin, bilirubin, … • nosiče či látky se specifickou funkcí (nejč. bílkoviny ) • albumin, IgG, fibrinogen, další srážecí faktory, CRP, … • enzymy • secernované • buněčné • markery abnormální proliferace a dediferenciace • mikrobiologické • tkáňové/buněčné • molekulární • proteiny • kvantitativní změna exprese • RNA • kvantitativní změna transkripce (genové exprese) • DNA • kvalitativní průkaz poruchy - např. mutace/polymorfizmy • velké – cytogenetika • malé - PCR • kultivace buněk in vitro • mikrobiologické

11. Enzymové markery • lokalizace enzymů • (1) secernované • plazma: enzymy srážení krve, ceruloplazmin, lipoproteinová lipáza • GIT: amyláza, elastáza, lipáza, peptidázy • (2) intracelulární • cytosolické, organelové, membránově vázané, (nukleární) • faktory ovlivňující koncentraci enzymů v plazmě • aktivita enzymu v buňce • lokalizace enzymu v buňce • propustnost cytoplazmatické membrány • míra poškození buněk • celková masa postižených buněk • rychlost eliminace enzymu • detekce enzymů • koncentrace • fyzikálně-chemicky (elektroforéza, chromatografie) • imunochemicky (ELISA, imunohistochemie v tkáňových řezech) • aktivita • stanovení reakční rychlosti za různých podmínek – pH, t, c substrátu • enzymový „vzorec“ orgánu • závisí na specifické aktivitě enzymu, zastoupení isoenzymů, změna v průběhu ontogeneze • uvolnění intracelulárních enzymů – indikátor poškození

12. Inhibitors Inhibitors Liver, kidney

15. Vybraná problematika z laboratorní medicíny

16. Laboratorní ukazatele v kardiologii

17. Laboratorní diagnostika nekrózy myokardu • klasicky • myoglobin • kreatinkináza (CK) • isoenzym CK-MB • troponiny I a T (TnI a TnT) • aspartátaminotransferáza (AST) • laktátdehydrogenáza (LDH) • nověji • heartfattyacidbinding protein (HFABP) • natriuretický peptid B (BNP) • ischemií modifikovaný albumin (IMA) • ve zkoušení • karboanhydráza III • lehké řetězce myosinu (MLC) • čím je molekula menší, tím rychleji uvolňována (clearance) • proteiny vázané na membránu jsou uvolňovány > než cytosolické> vázanénakontraktilní aparát • specificita pro myokard = troponiny 100%

18. Dynamika srdečních markerů v prvních hodinách v horizontu dní

19. Srdeční strukturální a funkční proteiny – časná diagnostika IM • myoglobin • intracelulární protein srdečních i kosterních svalových buněk účastnící se aerobního metabolismu • při poškození buněk se vzhledem k malé velikosti vyplavuje velmi rychle do krevního oběhu (za 0.5 až 2 h) • nejmenší ze srdečních markerů (~18kDa) - rychle se zvyšuje a velmi rychle se odbourává (normalizace do 24 hod.) • vzhledem k výskytu myoglobinu i v buňkách kosterních svalů je markerem nespecifickým • myopatie, úrazy, renální selhání • troponiny • troponinový komplex – součást strukturálních proteinů, které se podílí na kontrakci příčně pruhovaných svalů • heterotrimer složený z troponinů I, T a C • těsně spojen s kontraktilním aparátem – nízké koncentrace srdečních troponinů v oběhu • není-li srdeční sval poškozen, koncentrace TnI je prakticky nulová a to i při poškození kosterního svalstva = vysoká senzitivita • srdeční izoforma troponinu I (TnI) se strukturně liší od analogické izoformy v kosterním svalu – absolutní kardiospecificita

20. výhody stanovení TnI • absolutní kardiospecifita • dlouhá doba vylučování – sledování průběhu • senzitivita – detekce i menších poškození • není ovlivněn chronickou renální insuficiencí • nevýhody stanovení TnI • pomalejší nástup než myoglobin (který je nespecifický) • dlouho zvýšen – neumožňuje dg. reinfarktu

21. kreatinkináza (CK) cytoplazmatický a mitochondriální enzym katalyzuje reverzibilní přenos fosfátu z ATP na kreatin ATP + kreatin  ADP + kreatinfosfát dimerický enzym – 2 podjednotky M (muscle) B (brain) 3 izoformy CK-MM - kosterní sval a myokard CK-MB - myokard CK-BB - hladký sval, mozek, prostata CK-MB diagnóza akutního infarktu myokardu (i reinfarktu) a monitorování reperfuze během trombolytické léčby akutního infarktu myokardu subformy CK-MB1 (v cirkulaci) a 2 (tkáňová) poměr ukazuje akuitu IM AST ve vysokých koncentracích v játrech, svalu a myokardu LDH enzym přítomný v mnoha tkáních tetramer z LDH podjednotek M (gen LDHA, ch.11) H (gen LDHB, ch.12) celkem 5 isoforem: LDH1 (HHHH), 31-49% (myokard, ledviny, erytrocyty) LDH2 (HHHM), 38-58% (retikuloendoteliální systém) LDH3 (HHMM), 6-17% (plíce) LDH4 (HMMM), 0-0.7% (ledviny) LDH5 (MMMM), 0-1.5% (kosterní svaly, játra) celk. LDH není dg. pro IM, v myokardu nejvíce LDH1 poměr LDH1 / LDH2 > 1 podporuje dg. AIM v současnosti AST i LDH ztrácí význam v dg. AIM Srdeční enzymy

22. Dynamika kardiomarkerů

23. JATERNÍ MARKERY – akutní i chronická onemocnění jater

24. Dělení biochemických vyšetření jater • ukazatelé poškození hepatocytů • ALT, AST, LDH • ukazatelé obstrukce žlučových cest • ALP, GMT • ukazatelé syntetické funkce jater • albumin, srážecí enzymy, CHE, LCAT, …. • testy konjugace a jaterního transportu • bilirubin, urobilinogen

25. Alaninaminotransferáza (ALT) ~ <1ukat/l L-alanin + 2-oxoglutarát  pyruvát + L-glutamát reakce je reverzibilní, uplatňuje se při syntéze, odbourávání i přeměně aminokyselin cytoplazmatický enzym nejvíce je obsažen v hepatocytech, hladina zvýšena již při poruše membránové permeability normálně převažuje nad AST Aspartátaminotransferáza (AST) ~ <1ukat/l L-aspartát + 2-oxoglutarát  oxalacetát + L-glutamát reakce je reverzibilní, uplatňuje se při syntéze, odbourávání i přeměně aminokyselin cytoplazmatický a mitochondriální izoenzym obsažen zejm. v játrech, myokardu a kosterním svalu cytoplazmatický izoenzym se do krve dostává již při narušení permeability buněčné membrány, uvolnění mitochondriálního izoenzymu provází hepatocelulární nebo srdeční nekrózu Poškození hepatocytů

26. Interpretace ALT/AST • zvýšení aktivity ALT i AST u mnoha jaterních chorob • extrémně vysoké hodnoty (10-100x) u toxických a akutních virových hepatitid a šokových stavů • aktivita aminotransferáz v plazmě neříká nic o exkretorické či metabolické funkci hepatocytů • není jednoznačná korelace mezi hladinou aminotransferáz a (histologickou) závažností jaterní léze • De Ritisův index = AST/ALT • < 0.7 = dobrá prognóza • 1 a více = špatná prognóza (nekróza) • za normálního stavu i u většiny jaterních chorob je ALT>AST • AST/ALT >2 • alkoholické poškození • postnekrotické cirhózy

27. Poškození hepatocytů • Laktátdehydrogenáza (LDH) • játra hlavně LDH4 a LDH5 • přeměna pyruvátu na laktát ve tkáních s anaer. glykolýzou

28. Alkalická fosfatáza (ALP) membránový enzym katalyzující hydrolýzu fosfátových esterů při alkalickém pH především v játrech, střevě a kostech (různé izoenzymy) stanovení aktivity v séru se využívá hlavně k posouzení kostních a hepatobiliárních onemocnění značná část jaterní ALP v membránách buněk výstelky žlučových cest při cholestáze narušení membrán mechanicky a účinkem žlučových kyselin zvýšená exprese enzymu při přetlaku ve žluč. cestách kromě cholestázy zvýšená u mnoha dalších stavů (tumory jater, cirhóza) ‑glutamyltransferáza (GMT) membránově vázaný enzym katalyzující přenos  ‑glutamylu z glutathionu na aminokyselinu umožňuje tak transport aminokyseliny přes buněčnou membránu nacházející se v játrech, ledvinách a v prostatě stanovení aktivity GMT v séru se využívá pro posouzení hepatobiliárních onemocnění Obstrukce žlučových cest

29. Albumin tvořen v játrech, určení hladiny v séru dlouhý poločas – neklesá u akutních poruch pokles provází chron. jaterní onemocnění po vyloučení jiné příčiny poklesu malabsorpce, snížený přívod bílkovin, onemocnění ledvin výrazné snížení u alkoholických cirhóz Cholinesteráza (CHE) sekreční enzym produkovaný jaterními buňkami do krve v plazmě katalyzuje hydrolytické štěpení esterů cholinu a některých dalších substrátů pokles aktivity v plazmě u poškození jaterního parenchymu nebo při nedostatku proteinů v dietě nevratně je enzym inhibován organofosfáty Syntetická funkce jater

30. Cholinesteráza (CHE) vyskytuje se volný v plazmě pseudocholinesteráza, nespecifická cholinesteráza, cholinesteráza II, butyrylcholinesteráza Acetylcholinesteráza (ACHE) účastní se přenosu nervového vzruchu na cholinergních synapsích v plazmě se volný nevyskytuje (je však přítomen v erytrocytech) CHE vs. ACHE

31. Syntetická funkce jater • Hemokoagulační faktory • tvořeny v játrech, krátký poločas – jejich změny jsou rychlé • Quickův test – vnější cesta aktivace koagulačního systému • hodnoty se mění u onemocnění jaterního parenchymu provázených poruchou proteosyntézy • nebo u obstrukčního ikteru s poruchou vstřebávání tuků a v nich rozpustných vitaminů

32. Tumorové markery • látky tvořené nádorem nebo jinými tkáněmi jako reakce na maligní proces • nádorem tvořené • antigeny (dediferenciace) • hormony • enzymy • onkogeny a antionkogeny • s nádorem sdružené

33. Charakteristika ideálního onkomarkeru • kauzální souvislost s maligním procesem • korelace se stupněm malignity a stadiem nemoci • odhad histologického typu a lokalizace tumoru • posouzení efektu terapie a odhad prognózy • takový marker zatím nalezen nebyl

34. Charakteristika onkomarkerů v klinické praxi • specificita • procento zdravých s negativním nálezem • ti, kteří jsou vyšetřením správně hodnoceni jako zdraví • senzitivita • podíl nemocných, kteří byli správně klasifikováni jako nemocní • prediktivní hodnota • pravděpodobnost, že pacient, který je testován pozitivní je opravdu pozitivní a pacient, který je testován jako negativní je opravdu negativní

35. Charakteristika onkomarkerů v klinické praxi

37. Praktické cvičení stanovení izoenzymů LDH ve vzorku séra

38. Laktátdehydrogenáza (LDH) jako diagnostický marker • Tetramer z LDH podjednotek • M (gen LDHA, ch.11) • H (gen LDHB, ch.12) • Celkem 5 isoforem: • LDH1 (HHHH), 31-49% • myokard, ledviny, erytrocyty • LDH2 (HHHM), 38-58% • retikuloendoteliální systém • LDH3 (HHMM), 6-17% • plíce • LDH4 (HMMM), 0-0.7% • ledviny • LDH5 (MMMM), 0-1.5% • kosterní svaly, játra

39. Stanovení isoenzymů LDH • Isoenzymy se liší nábojem(=ELFO) • elektroforetická separace v agarózovém gelus barbitalovým pufrem • barvící roztok • laktát, NAD+, barvivo(NBT), fenazinmethosulfát (přenašeč elektronů mezi NADH a barvivem) • denzitometrické zhodnocení

40. Detekce elektroforetických drah • laktát+NAD+ pyruvát+NADH+H+ • NADH+H++tetrazoliová sůl (NBT)NAD++ formazan

41. Denzitometrické hodnocení