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第九章 生物物质分离与纯化. 王雪青. 9.1 概述. 生物物质分离（ Bioseparation) 是生物化工的一个重要的组成部分，常称之为下游过程（ Downstream processing ）。其与上中游同样重要，在某种程度上，甚至大于它们。前者解决丰产问题，而下游分离过程解决丰收问题。 生物物质的分离区别于其它物质的分离在于 A: 目的产物浓度很低。因此耗能、费用增高和产物的价格也相应的增加。 B: 生物物质易受环境因素如温度、 pH 、金属离子和微生物等的影响，增加了分离的难度。 C: 对终产品的质量要求极高。特别是医药产品或作为生物制剂的产品。
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第九章 生物物质分离与纯化 王雪青
9.1概述 生物物质分离（Bioseparation)是生物化工的一个重要的组成部分，常称之为下游过程（Downstream processing）。其与上中游同样重要，在某种程度上，甚至大于它们。前者解决丰产问题，而下游分离过程解决丰收问题。 生物物质的分离区别于其它物质的分离在于 A: 目的产物浓度很低。因此耗能、费用增高和产物的价格也相应的增加。 B: 生物物质易受环境因素如温度、pH、金属离子和微生物等的影响，增加了分离的难度。 C: 对终产品的质量要求极高。特别是医药产品或作为生物制剂的产品。 因此它是一项十分艰巨和耗资巨大的工作。对于传统发酵工业
来说，（如抗生素、乙醇、柠檬酸等生产), 分离和提纯部分费用占总投资的60%，而对基因工程菌的发酵占到90%，对其下功夫研究和设计是一项十分重要和有意义的工作。 表 9-1 几种典型产品发酵液的浓度
下游加工过程应遵循的原则 • 时间短； • 温度低 • pH适中 • 严格的清洗和消毒
下游加工一般工艺流程 发酵液 胞外产物 细胞分离 胞内产物 离心或过滤 离心或过滤 离心或过滤 细胞破碎 整体细胞萃取 干燥 含产物的清液 离心或过滤 产物 提取、分离 废物 纯化、精制 干燥 产物
一、发酵液的预处理 • 改变发酵液的性质，以利于固液分离。通过酸化、加热、以降低发酵液的黏度。 • 通过加入絮凝剂，使细胞或溶解的大分子聚结成较大的颗粒。絮凝剂为人工合成的高分子聚合物，如聚丙烯酰胺和聚乙烯亚胺衍生物，天然的有机高分子物质，如壳聚糖和葡聚糖的聚糖类，明胶和海藻酸钠，以及由微生物产生的物质如糖蛋白、粘多糖、纤维素和核酸等，絮凝法常可得到粗大的絮团。 • 通过加入一些中性盐，导致胶体出现凝聚的不稳定的现象。表征电解质凝聚能力的大小用凝聚价，即使胶粒 发生凝聚作用的最小电解质的浓度。因此反离子价数越高该值就越小，凝聚能力就越强。常用的凝聚剂为明矾，AlCl3·6H2O, FeCl3, ZnSO4, MgCO3。采用凝聚的方法得到的凝聚体颗粒比较小。
二、发酵液的固液分离 • 通过固液分离，去除了发酵液中的固相物质，为后续过程提供澄清或洁净的原料液体。通常采用的单元操作为过滤和离心。
Disc-Centrifuges Solids-retaining centrifuge Nozzle with pressurized discharge of concentrate Nozzle with peripheral nozzles Periodically solids-ejecting centrifuge with axial channels Periodically solids-ejecting centrifuge
三、细胞破碎 破碎方法 机械方法 非机械方法 流体剪切力 固体剪切力 干燥处理 溶胞处理 高压匀浆 酶溶法 化学法 物理法 超声法 球磨法 压榨法
压力破碎法：利用压力释放时的固液剪切进行破碎。操作简单，可连续操作，适用面广，但操作会产生热，需有冷却系统，同时破碎率低。压力破碎法：利用压力释放时的固液剪切进行破碎。操作简单，可连续操作，适用面广，但操作会产生热，需有冷却系统，同时破碎率低。 珠磨破碎法：利用固体的剪切进行破碎。操作简单，可连续/批式操作，适用面广，但操作会产生热，需有冷却系统，不同细胞的破碎条件差异大。 超声破碎法：利用超声波形成空穴产生压力冲击进行破碎。操作简单，可连续/批式操作，但操作会产生热，需有冷却系统，破碎率低，适应性差。 渗透压法：利用渗透压的突变，造成细胞内压力差而引起细胞的破碎。破碎率低，产物释放较好，操作复杂，条件要求苛刻，适用于少量样品的处理，费用高。 有机溶剂法：利用有机溶剂或表面活性剂改变细胞壁/膜的通透性，使包内产物释放的方法。该法简单，内含物释放少，产物较纯，可规模化生产，但适用面窄。
碱或酶处理法：利用碱或酶的处理是细胞壁或膜破坏，产物得以释放。该法简单，可规模化生产，但适用面窄。碱或酶处理法：利用碱或酶的处理是细胞壁或膜破坏，产物得以释放。该法简单，可规模化生产，但适用面窄。 选择破碎法的依据： 细胞的处理量： 大规模，则一般采用机械法，而实验室规模的，则选择非机械法。 细胞壁的强度和结构： 酵母和真菌，含有纤维素和几丁质，比细菌的胞壁强度大，应选择高压匀浆法。而对于有高度分之的微生物，会阻塞匀浆气阀而不能应用。 目的产物对破碎条件的敏感性： 破碎程度：由于破碎会使细胞碎片细小，使固液分离困难， 所以，适宜的操作条件是高的产物释放率，低能耗和便于后续提取三个方面权衡。
四、分离和纯化 主要任务是提高溶液中的产品的浓度，同时也取出一些杂质。传统的方法包括沉淀法、吸附法、离子交换、萃取法，另外，含有超滤、反渗透，电渗析、凝胶电泳等，常用的为蒸发、萃取和吸附。 1. 液体蒸发：又称浓缩，通过加热是溶液中的部分水汽化并出去，以提高溶液的浓度。蒸发的持续进行必须满足而个条件：其一，保证连续的提供不断汽化所需的热量，同时不断的移去二次蒸汽。 2. 液-液萃取：是一种常用的方法。应用于抗生素、有机酸、维生素、激素等发酵产物的分离和提取。特别是近20年，与其它的技术性结合产生了新的分离技术，用于提取酶、蛋白质、核酸、多肽和氨基酸。 如：反胶囊萃取（reversed micelle extraction), 超临界萃取（supercritical fluid extraction )和液膜萃取（liquid membrane extraction)等适合DNA重组技术和遗传工程的发展
Extractors 溶质在二个互不相容的溶剂的分配系数不同，所造成的溶质的转移。 混合器和澄清器
3. 双水相萃取； 二种互不溶的聚合物，这两种的聚合物中的含水率很高，一般在70-90%，这样就可以防止在有机相中的变性，同时这些高聚物含有保护和稳定蛋白质等生物活性物质的作用。
4. 反胶团萃取； 在有机相中加入一定量的表面活性剂，形成大小为毫微米级的微胶团。当此有机相与含有目的产物的水相形成液-液萃取时，由于微胶团中的表面活性剂带有与水相中的蛋白质相反的电荷，而将水相中的蛋白质迁移入微团内水池中，实现物质的提取。 5. 超临界萃取； 同样为溶剂萃取。而此方法使用的溶剂是在超临界状态下的液态气体，常用的为CO2, 它具有液体的密度和气体的高扩散性，产品分离容易等特点。受到广泛的关注。 • For pure CO2, the critical conditions ; Pressure(73atm), temperature(31.1°C)
6; 固体吸附： 是物质从液相（发酵液）到固相（吸附剂）发生物质的转移。此法用于蛋白质、核酸、氨基酸、抗生素等物质的分离和提取。 按照吸附剂的作用原理：分为三大类。 A物理吸附： 依靠范德华力的作用。吸附剂可用活性炭、硅藻土、硅胶、分子筛和氧化铝等。 B静电吸附： 借助静电引力吸附物质。主要为合成的树脂。 C: 亲和吸附： 在树脂上嫁接一个能与要分离的物质发生特异性反应的配基。
五、提纯 1，层析法（Elution Chromatography) 又称洗脱法/色谱法。他们与吸附法本质上是相同的。但在操作过程不同。造成了结果不同。 吸附法吸附和洗脱间断进行，收集洗脱液也为一次性、不分段。因此，只有浓缩而无分离。 层析法则是吸附和洗脱同时进行，分段收集洗脱液，因此分离和浓缩同时完成。 层析法又分为离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析
2：沉淀法 适合大规模生产，通过采取不同的手段使发酵液中目的物质溶解度降低，使之发生沉淀，达到分离提纯的目的。 常用等电点沉淀法、盐析法、加热沉淀法、有机溶剂沉淀法等 3. 超滤法 是一种半透膜，使溶液中的溶剂和小分子物质通过，而阻止截流大分子物质的方法。 超滤区别于常规过滤主要采用了错流手段消除浓差极化
4：电泳法 在电场的作用下发生的带电粒子定向运动，其移动的速度受到物质所带电荷多少而不同，依据此而进行分离纯化的方法。 该法无法实现规模化生产，价格贵。量少。
SDS PAGE of Purification 10 micrograms loaded in each lane
六、最后加工 包括结晶和干燥
Industrial Scale up • To transfer the pilot scale results into a commercially feasible production setting. • Fermentor sizes range from 100 L to 500,000 L, depending on products.
