Tehnike zasnovane na reakciji antigena i antitela

1. Tehnike zasnovane na reakciji antigena i antitela

2. Antigenost, imunogenost Prirodni antigeni - proteini, polisaharidi, lipidi, nukleinske kiseline, celijski i tkivni antigeni (kompleksi proteina, polisaharida i lipida) Ve�tacki antigeni - sintetski konstruisani polipeptidi - hemijski sastav potpuno poznat Antigene determinante ili epitopi - strukture na antigenu, koje odreduju njegovu specificnost i stupaju u kontakt sa antitelom i TCR i Paratop - deo antitela koji prepoznaje epitop na Ag Multivalentni antigeni

3. Imunogenost antigena zavisi od niza faktora slicnost sopstvenom velicina molekula hemijska grada molekula put uno�enja antigena oblik u kome se antigen unosi u organizam vecu imunogenost imaju partikularni od solubilnih antigena denaturisani antigeni su bolji imunogeni od nativnih antigeni u kombinaciji sa sporo oslobadajucim adjuvansom (bakterije) su bolji imunogeni, a sa brzo oslobadajucim (nebakterijski) su slabiji imunogeni interakcija sa MHC molekulima domacina genetski faktori

4. Hapteni - jedinjenja male molekulske mase nemaju imunogena svojstva Kompleks hapten�nosac - imunogena svojstva

5. Antitela - humoralni imunski odgovor - plazma celije hemijska struktura - familija imunoglobulina prepoznaju gotovo sve vrste biolo�kih molekula kao antigene, ukljucujuci jednostavne intermedijarne metabolite, ugljenehidrate, lipide, hormone, kao i makromolekule kao �to su fosfolipidi, nukleinske kiseline i proteini interaguju sa patogenima i njihovim toksicnim produktima u ekstracelularnom prostoru organizma, a T limfociti prepoznaju samo strane antigene koji su prikazani na povr�ini sopstvenih celija.

9. Reakcija antigena i antitela Prva faza - primarna reakcija izmedu antigena i antitela traje nekoliko sekundi, nije vidljiva i odlikuje se velikom specificno�cu Druga faza - sekundarna reakcija - vidljivi efekti primarne reakcije antigen-antitelo Tokom primarne reakcije epitop � paratop: komplementarnost, prisustvo nekovalentnih, vodonicnih, Van der Waals-ovih i hidrofobnih veza, kao i broj veza izmedu epitopa i paratopa

12. Anti-imunoglobulinska antitela

13. TESTS FOR ANTIGEN-ANTIBODY REACTIONS A. Factors affecting measurement of antigen-antibody reactions B. Agglutination Tests 1. Agglutination/Hemagglutination a. Qualitative agglutination test b. Quantitative agglutination test c. Applications of agglutination tests d. Practical considerations 2. Passive hemagglutination 3. Coomb's Test (Antiglobulin Test) a. Direct Coomb's Test b. Indirect Coomb's Test c. Applications 4. Hemagglutination Inhibition

14. C. Precipitation tests 1. Radial Immunodiffusion (Mancini) 2. Immunoelectrophoresis 3. Countercurrent electrophoresis D. Radioimmunoassay (RIA)/Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Competitive RIA/ELISA for Ag Detection Precipitation with ammonium sulphate Anti-immunoglobulin antibody Immobilization of the Antibody 2. Noncompetitive RIA/ELISA for Ag or Ab E. Tests for Cell Associated Antigens 1. Immunofluorescence a. Direct Immunofluorescence b. Indirect Immunofluorescence c. Flow Cytometry F. Complement Fixation 

15. Tip reakcije antigena i antitela zavisi od prirode antigena Solubilni antigen � imunoprecipitacija Partikularni antigen � imunoaglutinacija

16. Imunoprecipitacija Tecni medijum Interfacijalni test prstena - za detekciju Bacillus anthracus (Ascolijeva reakcija) Klasicna kvantitativna imunoprecipitacija Nefelometrija Polucvrsti medijum Dvostruka imunodifuzija Jednostruka radijalna imunodifuzija - RID

17. Nefelometrija brza i jednostavna metoda za kvantifikaciju mnogih antigena u razlicitim biolo�kim tecnostima (serum, plazma, likvor, sinovijalna tecnost, itd) me�anje konstantne kolicine visoko purifikovanog monospecificnog antitela i rastvora razlicitih koncentracija antigena mikroprecipitati lebde - zamucenje rastvora Stepen zamucenja se odreduje na osnovu rasipanja upadnog zraka svetlosti (nefelometrija) i proporcionalan je koncentraciji antigena

18. Dvostruka imunodifuzija kroz polucvrst medijum difunduju i antigen i antitelo i na mestu optimalnog odnosa obrazuje se precipitinska linija udaljenosti precipitinske linije od mesta nano�enja antigena i antitela zavisi od koeficijenta difuzije antigena i antitela, i njihove koncentracije Broj precipitinskih linija zavisi od broja prisutnih antigen-antitelo sistema Mogucnost detekcije broja antigena odnosno antitela, identifikaciju antigena ili antitela, i odredivanje srodnosti raznih antigena.

22. Jednosmerna radijalna imunodifuzija u gelu ravnomerno rasporedeno antitelo, a kroz gel difunduje samo antigen Antigen u bazencic iz koga difunduje u svim pravcima Na mestu ravnomerne koncentracije antigena i antitela obrazuje se precipitinski prsten Povr�ina obrazovanog kruga je merilo kolicine antigena i proporcionalna je pocetnoj koncentraciji antigena.

25. Imunoelektroforeza

28. Imunoelektroforeza Sredina XX veka Williams i Grabar kombinovana metoda elektroforeza i dvostruka imunodifuzija i izvodi se u gelu (agar, agaroza, skrob, poliakrilamid)

29. Imunoaglutinacija Direktna (odredivanje krvnih grupa, odredivanje titra antieritrocitnih at) Indirektna Obrnuta indirektna Antiimunoglobulinski test (Coombsov test) Direktan Indirektan Inhibicija hemaglutinacije (dokazivanje trudnoce)

30. Direktna imunoaglutinacija

31. Titar antitela je laboratorisjki test za odredivanje prisustva i kolicine antitela u serumu predstavlja reciprocnu vrednost najveceg razbla�enja seruma koje daje jasno vidljivu aglutinaciju.

32. Indirektna imunoaglutinacija Rose Waalerov test � za odredivanje prisustva anti-IgG antitela Stari test- Kada se ovciji eritrociti pome�aju sa odredenom koncentracijom antiseruma specificnog za ovcije eritrocite, a kada se doda serum pacijenata sa reumatoidnim artritisom dolazi do aglutinacije Test lateks aglutinacije

33. Coombsov test Koriste se anti-imunoglobulinska antitela da bi se detektovala antitela koja dovode do hemoliticke bolesti novorodenceta (lat. Erythroblastosis fetalis). Hemoliticka bolest novorodenceta -majka produkuje IgG antitela specificna za Rh antigen anti-Rh IgG antitela obla�u fetalne eritrocite, koji bivaju uni�teni od strane fagocita u jetri �to prouzrokuje hemoliticku anemiju fetusa i smrt novorodenceta Detekcija anti-Rh antitela je bila te�ka dok nisu otkrivena anti-humana imunoglobulinska antitela

36. Imunotestovi sa obele�enim antigenom ili antiteloam Radioimunotestovi (RIA) Enzimimunotestovi (ELISA) Imunohistohemijske tehnike

37. Radioimunotestovi (RIA) RIA u tecnoj fazi RIA u cvrstoj fazi Radioalergosorbent test (RAST) Radioiunmosorbent test (RIST) Odredivanje anti-DNK antitela

38. Enzimimunotestovi (ELISA) ELISA sa antigenom u cvrstoj fazi ELISA sa antitelom vezanim za zid ploce Jednostepeni sendvic test Vi�e stepeni sendvic test

42. Imunohistohemijske tehnike Imunoflorescenca Direktna Indirektna Protocna citofluorimetrija Imunoenzimske tehnike Tehnika imunoperoksidaznog bojenje Tehnika imnuoalkalnonofosfataznog bojenja