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microRNA

microRNA. (Real time Quantitative PCR). 北京康为世纪生物科技有限公司. microRNA. microRNA （ miRNA ） 长度 20 ～ 24nt 单链小分子 RNA 广泛存在于各种真核细胞中 不编码任何蛋白质 其基因常位于基因组非编码区 内源性表达，表达具时序性和组织特异性。 与目标基因 mRNA 相互作用，调控其表达水平 在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用. miRNA 作用靶点. 5’cap. mRNA. AAAAAAAA. 3’. 编码区. 分子功能.

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Presentation Transcript

  1. microRNA (Real time Quantitative PCR) 北京康为世纪生物科技有限公司

  2. microRNA microRNA（miRNA） • 长度20～24nt单链小分子RNA • 广泛存在于各种真核细胞中 • 不编码任何蛋白质 • 其基因常位于基因组非编码区 • 内源性表达，表达具时序性和组织特异性。 • 与目标基因mRNA相互作用，调控其表达水平 • 在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用

  3. miRNA作用靶点 5’cap mRNA AAAAAAAA 3’ 编码区 分子功能 • ∼22 nt 单链小RNA • 与目标基因3’端非编码区的识别位点相结合 • 导致目标基因mRNA分子稳定性下降，半衰期变短，或mRNA分子结构变化（5‘脱帽），从而表达水平下降

  4. microRNA 的来源

  5. miRNA前体与成熟体

  6. 靶点识别–不严格互补配对 • 一个miRNA可调节多个基因 • 一个基因可受多个miRNA调控 • 60%人类蛋白基因受miRNA调控

  7. miRNA 与 siRNA的异同 • 分子形式无区别，都是由Dicer产生的~22nt小分子 • 分子功能近似，都导致目标基因表达水平下降。但通常siRNA效果更剧烈 • 产生来源不同。 • miRNA有其基因，内源性表达 • siRNA多数情况下为人工外源导入

  8. miRNA 与 siRNA的异同 miRNA siRNA

  9. 命名规则 microRNA成熟体

  10. 命名规则–成熟体 • 传统名字：如let7 • 家族成员：加a，b, c…后缀，如let-7a • 主要产物：种名-miR-序号,如，has-miR-56 • 次要产物：加星号后缀，如， has-miR-56* • 主次不明：以5’或3’端区分，如，miR-142-5p (5‘ 端产物) 和 miR-142-3p (3’端产物arm) (老命名miR-142-s and miR-142-as. )

  11. miRNA分子功能总结 • 以非严格互补配对方式识别靶基因3’端非翻译区，只有~8nt的种子区（seed region）严格互补配对 • 一种miRNA分子可以不同威力调控多个靶基因，通常导致靶基因mRNA稳定性降低及其它翻译水平的表达下降（如，脱帽）。通常不导致mRNA剧烈降解 • 有个别报告 miRNAs与5‘端非翻译区结合导致靶基因上调表达 • 在植物中miRNA的分子功能可与siRNA相似，与目标靶点严格互补配对，导致目标基因mRNA分子急剧降解

  12. 权威数据库 miRBasewww.mirbase.org

  13. 2010年初数据库（v.14）包括 物种：115 人miRNA：721 小鼠miRNA: 579 大鼠miRNA：325 拟南芥miRNA ：190 2011年初数据库（v.16）包括 物种：142 人miRNA ：1048 小鼠miRNA : 672 大鼠miRNA ：408 拟南芥miRNA ：213 miRBase version 14

  14. miRNA annotationA uniform system for microRNA annotation. Ambros V, Bartel B, Bartel DP, Burge CB, Carrington JC, Chen X, Dreyfuss G, Eddy SR, Griffiths-Jones S, Marshall M, Matzke M, Ruvkun G, Tuschl T. RNA 2003 9(3):277-279 Expression criteria A. Detection of a distinct ∼22-nt RNA transcript by hybridization to a size-fractionated RNA sample (ordinarily by the Northern blotting method). B. Identification of the ∼22-nt sequence in a library of cDNAs made from size-fractionated RNA. Such sequences must precisely match the genomic sequence of the organism from which they were cloned (except as noted below). Biogenesis criteria C. Prediction of a potential fold-back precursor structure that contains the ∼22-nt miRNA sequence within one arm of the hairpin. In this criterion, the hairpin must be the folding alternative with the lowest free energy, as predicted by mfold (Mathews et al. 1999) or another conventional RNA-folding program, and must include at least 16 bp involving the first 22 nt of the miRNA and the other arm of the hairpin. It should not contain large internal loops or bulges, particularly not large asymmetricbulges. In animals, these fold-back precursors are usually about 60–80 nt, whereas in plants, they are more variable, and may include up to a few hundred nucleotides. D. Phylogenetic conservation of the ∼22-nt miRNA sequence and its predicted fold-back precursor secondary structure. The conserved hairpin should meet the same minimal pairing requirements as in criterion C, but need not be the lowest free energy folding alternative. E. Detection of increased precursor accumulation in organisms with reduced Dicer function.

  15. miRNA 检测与定量 经典方法: 放射标记 Northern杂交

  16. miRNA芯片–基因表达谱 • 基本原理：某物种全部已知miRNA集中于一张芯片。点杂交检测各miRNA丰度 • 所回答的问题：哪些miRNA是你所应该关注的 • 优点：高通量，全景观察 • 缺点：敏感度、特异性均有限，适用于初筛 • 需后续验证：qPCR

  17. miRNA 主要检测技术

  18. Pri-miRNA检测 必要性：不排除miRNA从前体到成熟体，从核内转运到核外的过程中存在调控机制的可能。

  19. Specific miRNA quantification by real time PCR – way to go 关键难点 • 太短 • 解决办法: 加长 • 丰度低 • 解决办法:小RNA提取 • 序列高度相似miRNA之间难以区分 • 解决办法 : 特殊设计的检测方法；小心设计引物与反应优化

  20. 成熟 miRNA qPCR检测- Poly(A)加尾法 优点： 简单直接，高效。一次逆转录获得的cDNA可用于多个目标分子的检测

  21. 成熟 miRNA qPCR检测 – 茎环法 优点：特异引物逆转录，理论上效率更高，检测更灵敏 缺点：茎环引物设计复杂；特异引物逆转录不便多基因检测

  22. 检测方法选择 • 依样本特性，检测目标多寡而定 • 康为技术服务经验举例： • 复旦大学某客户 • miRNA芯片提示10个miRNA在病人与正常人之间有显著差异表达 • 要求从66个外周血RNA样本中检测这10个miRNA • 加尾法 ，5个目标获得良好检测 • 颈环法，4个目标获得良好检测 • 1个目标的检测很难，尝试多种引物设计，调整反应体系

  23. microRNA检测难题

  24. 解决miRNA丰度难题 小RNA提取 • 基本原理 • 影响RNA分子与硅胶柱结合的因素 • chaotropic agent，如，盐酸胍 • 离子强度，如NaCl • 小分子有机溶剂，如乙醇 • 精心调整各组份配比，达成大、小RNA与硅胶柱结合的区分条件，分离去除大分子量RNA，富集小分子量RNA

  25. M 1 2 3 提取小分子量RNA M：Marker #1：康为柱式分离的小片段RNA #2：康为柱式分离的总RNA #3：沉淀法得到的总RNA

  26. 康为miRNA产品 小RNA提取试剂盒 加尾法 miRNA cDNA第一链合成试剂盒 miRNA荧光定量PCR检测试剂盒 CW0627 CW2141 CW2142

  27. 康为miRNA检测服务 全套miRNA检测：从生物样本到数据 茎环法 miRNA检测引物：定制

  28. 北京康为世纪生物科技有限公司 总机：010-58851919 免费电话：4006-222-360 网址：www.cwbiotech.com E-mail: ask@cwbiotech.com

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