Funkcije proteinov

1. Funkcije proteinov • Transport/skladiščenje določenih molekul (ligandov, npr. Hb, Mb) • Uravnavanje procesov (DNA-vezavni proteini) • Oporna funkcija (strukturni proteini, npr keratini, kolagen ...) • Kontraktilni proteini • Membranski proteini, vključeni v transport molekul/ionov preko membrane • Proteini, vključeni v prenos signala (receptorji, G-proteini, kinaze ...) • Obramba pred tujki/invazivnimi organizmi (Ig) • Kataliza biokemijskih reakcij (encimi)

2. Vezava ligandov na protein • Molekula – ligand se reverzibilno veže na protein • Ligand se veže na vezavno mesto proteina, ki je komplementarno glede velikosti in oblike liganda, naboja, hidrofobnih in hidrofilnih interakcij • Vezavno mesto je selektivno, torej specifično za določen ligand • Vezava liganda povzroči konformacijsko spremembo proteina, ki vodi k močnejši vezavi; strukturna adaptacija med proteinom in ligandom – inducirano prilagajanje • Pri multimernih proteinih povzroči vezava liganda na eno podenoto konformacijsko spremembo drugih podenot • Interakcije med proteini in ligandi so uravnavane s specifičnimi interakcijami drugih ligandov. Ti drugi ligandi povzročijo konformacijsko spremembo proteina, ki vpliva na vezavo prvega liganda.

3. Vezava liganda na protein: proteini, ki vežejo kisik mioglobin (Mb) in hemoglobin (Hb) • Prostetična skupina hem • Mioglobin – eno vezavno mesto za kisik • Kvantitativni opis interakcije protein-ligand • Transport kisika s hemoglobinom • Struktura Hb • Strukturne spremembe Hb po vezavi kisika • Kooperativna vezava kisika na Hb • Alosterični proteini – kvantitativni opis vezave • Hb prenaša tudi H+ in CO2 • Uravnavanje vezave kisika na Hb z 2,3-bisfosfogliceratom • Anemija srpastih celic

4. Topnost nekaterih plinov v vodi Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005 • Večje živali – potreba po sistemu, ki prenaša in shranjuje kisik • Za vezavo kisika primerni elementi prehoda – Fe veže kisik in ga s tem • naredi manj reaktivnega • Fe – bistven del prostetične skupine (hem) proteinov, ki vežejo kisik (Mb. Hb)

5. Prostetična skupina hem Fe s šestimi koordinativnimi vezmi • protoporfirin IX - hem • Fe vezano s 4 koordinatinvini vezmi na • N pirolovih obročev • (vsi atomi ležijo v isti ravnini) • 2 vezi sta prosti porfirin

6. Struktura mioglobina (Mb) • 3D struktura – globinsko zvitje (“fold”) • kompaktna molekula, v notranjosti • le 4 molekule H2O • 8 segmentov (A-H) -vijačnic (7-23 ak) • 75% strukture: α-vijačnica • hidrofobni –R v notranjosti, • hidrofilni –R proti vodnemu okolju • nehelični segmenti označeni AB, CD... • Pro na mestih β-zavojev • prostetična skupina hem vezan • v žep med E in F vijačnicama • Mb se nahaja v mišičnih celicah, rdeče/rjave barve • Mr = 16 700, 1 polipeptidna veriga, 153 ak • 3D strukturo ugotovil l. 1950, John Kendrew s sod. z uklonom Rtg. žarkov

7. Umestitev hema v protein (globin) Pogled s strani Ravnina, v kateri leži porfirin • Fe vezano s 4 vezmi v hemu, • z eno vezjo na His ostanek proteina, • prosta ostane ena koordinavina vez • za ligande • O2 • NO • CO His

8. Reverzibilna vezava kisika na Mb: Mb + O2 ↔ MbO2 distalni His (vijačnica E) v Mb proksimalni His (vijačnica F)

9. Reverzibilna vezava liganda na protein P – protein L – ligand PL – kompleks protein-ligand P + L ↔ PL Ka – asociacijska konstanta za nastanek kompleksa PL Kd – disociacijska konstanta kompleksa PL

10. Vezava liganda (L) na protein: enačba in grafična predstavitev • Vezava kisika na Mb: Mb + O2 ↔ MbO2 Ligand L – O2  – delež zasedenih vezavnih mest Kd – disociacijska konstanta kompleksa MbO2 pO2 – parcialni tlak kisika P50 – parcialni tlak kisika, kjer je 50% vezavnih mest zasedenih Koncentracijo plinov izražamo s parcialnim tlakom plinov - p

11. Disociacijske konstante nekaterih kompleksov protein·ligand

12. Sterični vplivi za vezavo liganda (O2, CO) na hem Mb Vezava CO na hem v raztopini: CO veže z 200 000 x večjo afiniteto kot O2 • Vezava kisika pod določenim kotom • Vezava CO pravokotno na ravnino hema Vezava CO in O2 na hem v Mb: Zaradi prostorskih ovir, ki jih predstavlja His v vijačnici E7, se O2 veže pod določenim kotom na Fe v hemu His v E7 Mb prepreči vezavo CO pod pravim kotom – afiniteta Mb do CO le še 200x večja kot do O2

13. Mb ni primeren za prenos kisika iz pljuč v tkiva Vezava O2 na Mb • Razmere v pljučih: PO2 13,3 kPa oz. 90 mm Hg • Razmere v tkivih: PO2 4 kPa oz. ~30 mm Hg • Glede na vezavno krivuljo bi bil O2 stalno vezan na Mb • Mb ni primeren prenašalec kisika od pljuč v tkiva • To nalogo opravlja hemoglobin (Hb)

14. Hb se nahaja v eritrocitih Eritrociti – nepopolne celice, namenjene prenosu O2 V citosolu vsebujejo ~34% Hb Arterijska kri ~96% zasičena s kisikom, venska ~64% → O2 se sprosti v tkivih, kjer se porabja za oksidacijo metaboličnih hranil (glukoza), pri čemer nastajata CO2 in H+, ki se prenašata iz tkiv v pljuča Hb prenese v telesu 500 g O2/dan = 15,6 molov O2/dan Kisik se prenaša po krvi s hemoglobinom (Hb) • Eritrociti – ploščate krvne celice • premera  6-9 m • Rdeča barva izvira is hema

15. Vloga Hb v prenosu kisika oksigeniran Hb neoksigeniran Hb tkiva pljuča srce O2 dobimo z dihanjem in se prenaša iz pljuč (PO2 13,3 kPa oz. 90 mm Hg) v tkiva (PO2 4 kPa oz. ~30 mm Hg)

16. Hemoglobin (Hb) • Hb: tetramer (α2β2) kroglaste oblike, Mr 64 000 • α veriga: 141 ak ostankov, β veriga 145 ak ostankov • Hb zarodka: ζ veriga (podobna α) in ε veriga (podobna β) • 3D struktura štirih verig Hb je tetraednična • Hemi se nahajajo v vdolbinah na zunanjosti molekule • Ak zaporedje verig Hb in Mb ni enako, samo 27 ak ostankov identičnih, terciarna struktura zelo podobna – globinsko zvitje • Hb veže O2 Hb + O2 <-> HbO2 HbO2 + O2 <-> Hb(O2)2 Hb(O2)2 + O2 <-> Hb(O2)3 Hb(O2)3 + O2 <-> Hb(O2)4 Sumarna reakcija: Hb + 4O2 -> Hb(O2)4 2 2 2 1 ( Mb + O2↔ MbO2 )

17. Primerjava strukture Mb in β-podenote Hb Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

18. Najpomembnejše interakcije med neenakimi podenotami Hb (αβ) Največ šibkih interakcij med neenakima podenotama Največ šibkih interakcij med neenakima podenotama • Hb obstaja v dveh konformacijah: stanju R (relaxed) in stanju T (tense) • O2 ima večjo afiniteto do stanja R • Stanje T stabilizirano, če ni kisika, stanje T-deoksihemoglobin • Vezava kisika povzroči konformacijsko spremembo T→R

19. Stabilizacija T konformacije Hb z ionskimi interakcijami Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

20. Prehod Hb iz stanja T v stanje R Hb HbO2

21. Konformacijska sprememba v Hb v bližini hema po vezavi kisika • Vezava kisika na Fe v hemu spremeni 3D strukturo hema (sploščenje molekule) • Sprememba 3D strukture hema se odrazi na proteinskem delu molekule, ki je • povezana s hemom preko his ostanka → konformacijska sprememba proteina

22. Konformacijska sprememba Hb po vezavi kisika

23. Kooperativna vezava O2 na Hb – sigmoidna vezavna krivulja Stanje R - visokoafinitetno stanje Prehod iz nizko v visokoafinitetno stanje Stanje T – nizkoafinitetno stanja Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

24. Alosterični proteini • Vezava liganda (modulatorja) na eno vezavno mesto spremeni vezavne lastnosti drugih vezavnih mest • Konformacijska sprememba, povzročena z vezavo modulatorja: manj aktiven protein v bolj aktiven protein • Modulatorji: inhibitorji ali aktivatorji • Modulator - normalni ligand, homotropična interakcija • Modulator - druga molekula, heterotropična interakcija • Hb in O2 – pozitivna homotropična interakcija (modulator O2 je aktivator); kooperativna vezava, značilna sigmoidna krivulja

25. Strukturne spremembe multimernega proteina – kooperativna vezava liganda stabilno manj stabilno nestabilno

26. Hb prenaša tudi CO2 in H+ med pljuči in mišicami CO2, ki nastaja z oksidacijo organskih hranil, reagira z vodo (reakcijo katalizira encim karbonska anhidraza) CO2 + H2O ↔ HCO3- + H+ Reverzibilna vezava kisika na Hb: Hb + O2 ↔ HbO2 Na vezavo kisika na Hb vpliva H+ (Bohrov efekt) HbO2 + H+ ↔ HHb+ + O2 Posledica: - v pljučih se na Hb veže kisik, sprosti se H+ - v tkivih se s HbO2 sprosti kisik, veže se H+

27. Vpliv pH na vezavo kisika na Hb O2 in H+ se vežeta na Hb z obratno afiniteto

28. Vezava CO2 na Hb- CO2 se veže na N-konec polipeptidne verige, nastane karbamat Bohrov efekt karbamat H+ in CO2 ojačita kooperativno delovanje O2 med podenotami Hb

29. Heterotropični alosterični modulator vezave O2 na Hb - 2,3-bisfosfoglicerat BPG • Visoka koncentracija BPG v eritrocitih • BPG se veže v centralni žep med β podenotami v stanju T – 1 molekula BPG se veže na 1 molekulo Hb • Vezavni žep za BPG izgine po prehodu T → R stanje • BPG zniža afiniteto do O2, stabiliziraT stanje Hb HbBPG + O2↔ HbO2 + BPG T stanje R stanje

30. Vezava 2,3-bisfosfoglicerata na Hb v T stanju

31. Vpliv koncentracije BPG na vezavo O2 na Hb • Normalna konc. BPG v krvi na višini morske gladine ~ 5 mM • Konc. BPG v krvi na višjih nadmorskih višinah ~ 8 mM

32. Modulatorji aktivnosti alosteričnega proteina Hb glede vezave O2 • O2 - pozitivni homotropični modulator vezave O2 na Hb • CO2, H+, BPG negativni heterotropični modulatorji vezave O2 na Hb – vsi se vežejo na Hb z obratno afiniteto kot O2

33. Najpomembnejši človeški Hb

34. Vezavna krivulja Hb matere in zarodka Zaradi večje afinitete zarodkovega Hb do kisika je omogočen prenos kisika iz materine v zarodkovo kri

35. Motnje pri prenosu O2 po krvi • Vezava CO na Hb • Oksidacija Fe2+ vFe3+ • Cianoza 1. Vpliv CO na vezavo O2 na Hb

36. 1. Vpliv CO na vezavo O2 na Hb Koncentracija CO v krvi odvisno od koncentracije CO v okolju Vezavne krivulje O2 na Hb Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

37. 2. Oksidacija Fe2+ vFe3+ v hemu: methemoglobim • methemoglobin ne veže O2 • methemoglobin normalno prisoten do 3% • oksidanti (anilinska barvila, aromatske nitro spojine, nitriti) spremenijo Fe2+ vFe3+ • obramba eritrocitov pred oksidacijoFe2+ vFe3+ - eritrociti vsebujejo antioksidante (askorbinska kislina, glutation) - encim methemoglobin-reduktaza reducira Fe3+ vFe2+ (redek genski defekt: pomanjkanje reduktaze → kongenitalna methemoglobinemija; zdravljenje z barvilom mtilensko modro)

38. 3. Cianoza • bolnik ima sivo/škrlatno barvo kože • vzrok – visoka koncentracija deoksi-Hb pod površino • zvišana koncentracija deoksi-Hb je posledica bolezni srčnega ali pljučnega sistema → slaba cirkulacija → nezadostna oksigenacija krvi • anemični bolniki niso cianotični – imajo premalo Hb v krvi

39. Nenormalna tvorba Hb - bolezni • Ak zaporedje globinskih verig je določeno v globinskih genih (kromosoma 11 in 16) • Znanih je ~ 1000 nenormalnih Hb • Hemoglobinopatije – nastanek nenormalnih globinskih verig (primer srpasta anemija - HbS) • Talasemije – globinske verige so strukturno normalne, nastajajo pa v manjši količini ali določene verige sploh ni - napaka v regulatornem delu globinskega gena (primer talasemija α, talasemija β)

40. Srpasta anemija Hemoglobin A Hemoglobin S (a) normalni eritrocit vsebuje HbA (b) Okvarjeni eritrocit vsebuje HbS) (a) Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

41. Vzrok za nastanek HbS (α2βS2) – mutacija v β verigi Hb: Glu → Val Val Glu • HbS - nespremenjena hitrost sinteze Hb • HbS - nespremenjena afiniteta do O2 • HbS - hidrofobne interakcije med Val na površini  verige Hb → zlepljanje molekul HbS • zmanjšana topnost HbS v deoksigenirani obliki • netopni skupki HbS preprečujejo normalen pretok krvi v kapilarah

42. Srpasta anemija – heterozigoti (70% HbA in 30% HbS) • prisotnost HbS se pri normalnih razmerah sploh ne pokaže • težave v velikih višinah (znižan PO2) in pri intenzivni obremenitvi • rezistentni na malarijo – parazit malarije (Plasmodium falciparum) ne preživi v srpastih eritrocitih Geografska pojavnost srpaste anemije

43. Talasemije • globinske verige strukturno normalne • globinske verige nastajajo v manjši količini • ali določene verige sploh ni • napaka v regulatornem delu globinskega gena • talasemija α - napake pri nastajanju α verig • talasemija β - napake pri nastajanju β verig

44. α-talasemije:teža bolezni pogojena s številom delecij gena za α-globin Tihi nosilec α-talasemija minor 1 delecija 2 deleciji (na istem ali na različnih kromosomih) bolezen se ne zrazi ni simptomov ni kliničnih simptomov, rahla anemija Bolezen se ne i Fetalni Hb - Bartov sindrom Hemoglobin H 3 delecije 4 delecije anemija intrauterina hipoksija zarodek umre

45. β-talasemije: mutacije v β-globinski podenoti • β0 talasemija – ni β-verige • β+ talasemija – zmanjšana tvorba β-verig