TECHNIQUES SPECIALES EN ANATOMIE PATHOLOGIQUE

1. TECHNIQUES SPECIALESEN ANATOMIE PATHOLOGIQUE ED n°2, DCEM1 Purpan, 2011-2012

2. Techniques spéciales • Microscopie électronique • Histoenzymologie • Immunohistochimie • Biologie moléculaire • Cytométrie en flux • Télépathologie

3. Immunohistochimie • Techniques • Matériel • coupes en paraffine ou coupes en congélation • Mode de visualisation • Immunofluorescence (UV) • Immunoenzymatique (peroxydase ou phosphatase alcaline- lumière blanche) • Interprétation • batterie d’anticorps • témoins intrinsèques, réactivité croisée

4. Immunohistochimie 1 = Antigène 2 = Anticorps primaire 3 = Anticorpssecondaire couplé au complexe avidine-biotine péroxydase 4 = Révélation par substrat de la peroxydase

5. Immunohistochimie • Applications • pathologie hémolymphatique • Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels • classification des lymphomes • pathologie tumorale • identification des tumeurs malignes indifférenciées • substance spécifique de certaines tumeurs • expression des R hormonaux • évaluation de la croissance tumorale • recherche cibles thérapeutiques • pathologie non tumorale • pathologie rénale : glomérulopathies • pathologie cutanée bulleuse • pathologie inflammatoire (ex: agent pathogène)

6. Immunohistochimie • Applications • pathologie hémolymphatique • Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels • classification des lymphomes • pathologie tumorale • identification des tumeurs malignes indifférenciées • substance spécifique de certaines tumeurs • expression des R hormonaux • évaluation de la croissance tumorale • recherche cibles thérapeutiques • pathologie non tumorale • pathologie rénale : glomérulopathies • pathologie cutanée bulleuse • pathologie inflammatoire

7. Ag HbS

8. Immunohistochimie • Applications • pathologie hémolymphatique • Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels • classification des lymphomes • pathologie tumorale • identification des tumeurs malignes indifférenciées • substance spécifique de certaines tumeurs • expression des R hormonaux • évaluation de la croissance tumorale • recherche cibles thérapeutiques • pathologie non tumorale • pathologie rénale : glomérulopathies • pathologie cutanée bulleuse • pathologie inflammatoire

9. Immunohistochimie Exemple utilisation des anticorps monoclonaux dans le diagnostic des tumeurs malignes sur coupes en paraffine

10. Immunohistochimie • applications

11. Ganglion médiastinal HE

12. Ganglion médiastinal HE

13. Ganglion médiastinal IHC anti-CD45

14. Ganglion médiastinal IHC KL1

15. KL1+ • Anti-CD45- Métastase ganglionnaire d’un carcinome

16. Tumeur cutanée indifférenciée

17. Tumeur cutanée indifférenciée: IHC KL1

18. Tumeur cutanée indifférenciée:IHC HMB45

19. Tumeur cutanée indifférenciée:IHC anti-protéine S100

20. KL1- • HBM45+ • Anti-PS100+ Mélanome

21. Immunohistochimie • Applications • pathologie hémolymphatique • Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels • classification des lymphomes • pathologie tumorale • identification des tumeurs malignes indifférenciées • substance spécifique de certaines tumeurs • expression des R hormonaux • évaluation de la croissance tumorale • recherche cibles thérapeutiques • pathologie non tumorale • pathologie rénale : glomérulopathies • pathologie cutanée bulleuse • pathologie inflammatoire

22. Ganglion cervical métastatique, HE

23. Métastase d’un adénocarcinome thyroïdien Ganglion cervical métastatique: IHC anti-thyroglobuline

24. Immunohistochimie • Applications • pathologie hémolymphatique • Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels • classification des lymphomes • pathologie tumorale • identification des tumeurs malignes indifférenciées • substance spécifique de certaines tumeurs • expression des R hormonaux • évaluation de la croissance tumorale • recherche micrométastases • pathologie non tumorale • pathologie rénale : glomérulopathies • pathologie cutanée bulleuse • pathologie inflammatoire

25. Mélanome et ganglion sentinelle: recherche de micrométastase par immunohistochimie avec HMB45, non décelable sur H&E Ganglion sentinelle + = Curage ganglionnaire

26. Techniques spéciales • Microscopie électronique • Histoenzymologie • Immunohistochimie • Biologie moléculaire hybridation in situ PCR • Cytométrie en flux • Télépathologie

27. Biologie moléculaire • Hybridation in situ • Techniques • Coupes en paraffine ou coupes en congélation • Sondes froides (= non radio-actives) • Chromogéniques (CISH) • Fluorescentes (FISH) • Applications • Détection du génome de certains virus • Détection de translocations chromosomiques, d’amplification génique

28. HPV

29. Détection par FISH d’une fusion entre les chromosomes 17 et 22 dans une lésion cutanée Utilité diagnostique: Sarcome de Darier-Ferrand

30. Détection par FISH d’une amplification du gène HER2 dans un carcinome mammaire DuoCISH™, Dako HER2 / Cen17 Non amplifié Amplifié Utilité thérapeutiquePrescription d’un inhibiteur de Erb-2

31. Biologie moléculaire • PCR (Polymerase Chain Reaction) • Rappel de son principe • Technique • Applications

32. 1/ Principe de la PCR 3 étapes: - dénaturation thermique: 94°C, 30s à 1 mn - hybridation des amorces (annealing): 40 à 70°C,1 min - élongation: 72°C, durée variable selon le fragment à amplifier Dénaturation + Hybridation + Elongation = 1 cycle au cours duquel quantité ADN cible x 2. Au bout de n cycles: 2n molécules ADN cible.

33. 2/ Principales étapes de la technique

34. 3/ Applications en anatomie pathologique Anomalies géniques • Mutation • Translocations chromosomiques Mise en évidence de la clonalité lymphoide

35. Mutation Ex: mutation du gène BRAF dans le mélanome métastatique Séquençage du produit PCR correspondant à l’amplification de la zone du gène où se situe la mutation Intéret thérapeutique (prescription d’un inhibiteur de BRAF)

36. Amorce B CHR 2 CHR 5 Gène A Gène B Amorce A Translocation chromosomique Détection par PCR à l’aide de deux amorces encadrant la zone réarrangée Intérêt diagnostique (translocation spécifique de tumeur) Intérêt pronostique (ex: recherche de la maladie résiduelle après traitement d’un lymphome porteur de cette translocation)

37. TCR pour lymphocyte T Ig pour lymphocyte B Polyclonalité et monoclonalité lymphoide Prolifération polyclonale bénigne Prolifération monoclonale maligne Comment établir le caractère clonal ou polyclonal ? Identité ou non-identité du récepteur à l’Ag qui caractérise un lymphocytedonné Intérêt diagnostique

38. V D J Monoclonal Etablissement de clonalité par PCR V D J Polyclonal

39. Contraintes a- ADN de bonne qualité * délai de congélation * qualité et temps de fixation (Formol) b- Contaminations - lors des coupes (changer de lames, de gants entre chaque cas, nettoyer le support de lames) - lors de toutes les phases d’extraction d’ADN, d’amplification et d’électrophorèse. c- Contrôles : Témoin négatif (eau) Témoin positif

41. Les immunoglobulines (Ig): récepteurs à l’antigène des lymphocytes B Partie variable des Ig: carte d’identité d’un lymphocyte B

42. La diversité combinatoire

43. La diversité jonctionnelle J N V N D C2 Zone jonctionnelle 1/ Délétion de nucléotides en aval de V, en amont de J ou de part et d’autre de D 2/ Addition aléatoire de nucléotides (TdT)

45. A T T G C T A A C G A T T G C T A A C G PCR 1- BREF RAPPEL double hélice ADN • 2 brins antiparallèles • enchaînement de bases reliées entre elles par des liaisons hydrogènes faibles et thermolabiles : A T T G C T A A C G dénaturation thermique molécule double brin 2 molécules simple brin

46. CHR 2 CHR 5 amorce amorce Applications Maladies infectieuses : Virus (HPV : non cultivable,CMV: rejet de greffe rénale, VIH...), bactéries (à croissance lente : mycobactéries)… Anomalies géniques - Mutation- Translocation chromosomique détection de la t(14;18) par PCR: amplification de la zone jonctionnelle, variable d’un clone à l’autre. t(2 ;5) et lymphomes anaplasiques à grandes cellules - Etablissement de la clonalité lymphoïde