Praktiká ZS 4 Mycobacterium, Corynebacterium

1. Praktiká ZS 4 Mycobacterium, Corynebacterium • Lab. dg mykobaktérií + citlivosť na ATB • Lab dg. corynebaktérií + citlivosť na ATB • Lyzogénna konverzia • Antituberkulotiká • Mikroskopia - M.tbc - Ziehl Neelsen, C, diphtheria - Gram, Albert, C. pseudodiphthericum - Gram • Kultivácia - M. tbc - Lowensteinova a tekutá pôda, C. diphtheria a C. pseudodiphthericum - KA a teluritová pôda • Biochemické vlastnosti C.diphtheriae a C. pseudodiphthericum • Dôkaz toxigenicitiy C, diphtheriae - ELEKova metóda a pokus na zvierat

2. Lab. dg. mykobaktérií • Odber materiálu - pľúcna tbc - spútum - ranné spútum, 3 dni za sebou, mimopľúcna - adekvátna vzorka - veľké množstvo tekutiny - moč, menštruačná krv… • Mikroskopia - Ziehl Neelsen, fluorescencia - zvýšenie citlivosti • Kultivácia - spracovanie - dekontaminácia sprievodnej flóry, zahustenie vzorky - NaOH, centrifugácia. Vaječné pôdy - Šulova, Lowensteinova / tuhé aj tekuté / - pigment, tvar - karfiolovitá, v zákale, v blanke, v sedimente--- Dlhý generačná čas - urýchlenie - použitie detekcie metabolizmu kys. Palmitovej a CO2 • Genetické sondy - dôkaz sekvencie aminokyselín

4. Mycolic acids Lipid-Rich Cell Wall of Mycobacterium CMN Group: Unusual cell wall lipids (mycolic acids,etc.) (Purified Protein Derivative)

5. Farbenie • Ziehl Neelsen - teplom fixovaný vysušený náter prikryte filtračným papierom. Aplikujte 5-7 kvapiek karbolfuchsínu. Zahrievajte od spodu až do výstupu pár. Odstráňte papier pinzetou, opláchnite vodou a vysušte. Odfarbujte kyslým alkoholom (HCl+etanol) pokiaľ odchádza farba. Dofarbite metylénovou modrou. Opláchnite, vysušte. M. tbc - červené, okolie - slabo modré. • Albert - methylénová modrá alebo toluidínová modrá

6. Mikroskopia • Farbenie podľa Ziehl Neelsena - acidorezistencia M. tbc - ťažko prijíma farbivo. Ak ho príjme veľmi odoláva odfarbeniu aj silnými kyselinami • Farbenie podľa Grama C. diphtheria - G+kyjakovité paličky • Farbenie podľa Alberta - metachromatické farbenie granúl - výsledná farba je iná ako farba použitej farbičky - C. diphtheriae • Porovnanie Gramom farbený preparát C. diphtheriae a C. pseudodiphthericum

7. Fluorescenčný mikroskop • Používa ortuťovú vákuovú lampu, ktorá emituje svetlo kratších vlnových dĺžok v porovnaní so svetlom používaným v svetelnom mikroskope. • Využívajú fluorochromy – zlúčeniny schopné absorbovať krátkovlnné utrafialové alebo ultramodré svetlo a emitovať energiu vyšších vlnových dĺžok. Fluorochomy sa použijú na prípravu preparátu – fluorescenčné farbenie – ktorý po osvetlení krátkovlnnýms svetlom fluoreskuje • Vysoká citlivosť – organizmus alebo štruktúra svieti (fluoreskuje) na tmavom pozadí

8. Mycobacterium Tuberculosis Stained with Fluorescent Dye

9. Acid-fast bacilli

10. Kultivácia M. tbc • Vaječná pôda - Lowensteinova - karfiolovitý vzhľad, netvorí oigment • Tekutá pôda - rast v blanke • kultivácia 3-6 týždňov - odčítavanie každý týždeň

11. Eight Week Growth of Mycobacterium tuberculosis on Lowenstein-Jensen Agar

12. Antituberkulotiká a liečba • Streptomycin(zabíja aktívne sa množiace M.tbc) Izoniazid,Rifampicin (účinné na M.tbc v kazeóznych ložiskách) Ethanbutol Etionamid Kanamycin Cycloserin Pyrazinamid ( účinkuje i.c.) • U pacienta s pľúcnou tbc existujú 3 populácie M.tbc - lokalizované extracelulárne v kavite, - lokalizované intracelulárne v makrofágoch, - lokalizované vo vnútri kazeózneho ložiska • Kombinácia 2-3 ATT. Oddialenie vzniku rezistencie -prerastanie rezistentných mutant - rezistentné mutanty v kultúre M-tbc pre INH 1:105 pre STM 1:106 . V ložisku je 107- 10 9 baktérií

13. Mycobacterium tuberculosis (cont’d) • PPD Test (cont’d) Positive Test

14. Lab. dg. corynebaktérií • Diagnostika ochorenia na základe klinického obrazu a epid. anamnézy. Lab. dg. je dlhá. Odber vhodnej vzorky - • Mikroskopia - preparát farbený podľa Grama a Alberta - neodlíši C. diphtheriae od iných Corynebacterií. • Kultivácia: Krvný agar - 3 typy kolónií, Lofflerovo medium, pôda s teluričitanom - hnedé kolónie s halo • Biochemická identifikácia - odlíšenie od iných corynebacterií prítomných v krku • Dôkaz toxigenicity kmeňa - ELEK, • Testovanie citlivosti na ATB

15. Diphtheria

16. Arrangement of C. diphtheria

17. Diphtheroids gram stain

18. Lyzogénna konverzia • Kmeň C. diphtheriae získava vlastnosť produkcie toxínu - lyzogénnou konveziou prostredníctvom bakteriofága. Bakteriofág - bakteriálny vírus - prenesie genetickú informáciu o produkcii toxínu - tox gen - pri napadnutí bakteriálnej bunky C. diphtheriae

19. Mechanism of Action of Diphtheria Toxin: Inhibition of Protein Synthesis

20. Dôkaz toxigenicity C. diphtheriae • ELEKOV test toxigenicity - imunodifúzia skúmaného kmeňa a antidifterického séra imunodifúziou v agare - zóna precipitácie • Pokus na zvierati: aplikácia difterického toxínu i.d. ………………..nekróza • antidifterické sérum (i.p. alebo i.d.) + toxín …bez nekrózy

21. Elek plate

22. In vivo Detection of Diphtheria Exotoxin

23. Kultivácia Corynebaktérií • C. diphtheriae - na KA • C. pseudodiphthericum na KA - obrátený CAMP • C. diphtheria na telluritovej pôde - hnedé kolónie s hnedým prstencom - halo

24. Biochemické vlastnosti • Fermentácia: odlíšenie C. diphtheriae od iných corynebactérií izolovaných z krku (C.ulcerans, C. pseudotuberculosis, C. xerosis, C. pseudodiphthericum • C. diphtheriae • granuly kataláza želatína, urea, laktóza, maltóza, glc • + + - - - + + • + + - + - - - • C. pseudodiphthericum

25. Určenie citlivosti • Citlinosť na antituberkulotiká - ATT sú primiešané do pôdy, • Testuje sa princípom proporcionálnej metódy testovania citlivosti - dilučná metóda. Riedenie inokula aby na pôde bolo 100-300 CFU - colony forming units - kolóniu tvoriacich jednotiek. • Ak je in vitro viac jako 1% baktérií M. tbc rezistentných, terapia nebude klinicky účinná • Citlivosť na Corynebaktérie - PNC, ERY - na odstránenie baktérií alebo likvidáciu nosičstva - terapia diftérie - primárne antitoxická. Prevencia. • Nondiphtheria corynebactria - Vancomycin, (Cefalosporíny 1. generácie)