Download
1 / 39
410 likes | 651 Views
מאלפי הגנים קובץ מחקרים בביוטכנולוגיה. עריכה ועיצוב מצגת – תמי צור 2004. פרק ב' – שיבוט גנים וביטויים בחיידקים ובתרביות תאים. ביוטכנולוגיה המבוססת על הנדסה גנטית מאפשרת העברת גנים בין מינים רחוקים (שבירת מחסום המינים). מבנה החומר התורשתי. ייצוגים סכמתיים שונים של מולקולת DNA דו גדילית.
E N D
מאלפי הגניםקובץ מחקרים בביוטכנולוגיה עריכה ועיצוב מצגת – תמי צור 2004
פרק ב' – שיבוט גנים וביטויים בחיידקים ובתרביות תאים • ביוטכנולוגיה המבוססת על הנדסה גנטית מאפשרת העברת גנים בין מינים רחוקים (שבירת מחסום המינים)
מבנה החומר התורשתי ייצוגים סכמתיים שונים של מולקולת DNA דו גדילית. בהמשך, נשתמש בכל אחת מדרכי התצוגה האלה לחלופין.
ב. החומר התורשתי. א. החומר התורשתי בחיידק
מ DNA לתכונה • רצף DNA המקודד לחלבון או RNA, מכונה גן. • הגדרה רחבה יותר – • גן – מקטע DNA שמכיל את היחידה התפקודית שקובעת תכונה תורשתית (או חלק ממנה), בדרך כלל חלבון או RNA. • הגן כולל את האזורים המקודדים לחומצות אמיניות, ביחד עם אזורי הבקרה והאזורים שעוברים עריכה ושחבור.
שרשרת חומצות אמיניות יוצרת את המבנה הראשוני של החלבון. מבנה שלישוני של חלבון.
ישנן תכונות שלא נראות לעין • חשוב לדעת – • ישנן תכונות שמופיעות כתוצאה מפעילות של גן יחיד (קצב הגידול של אורגניזם כמו דג הסלומון משתנה בהשפעת הורמון הגדילה, המקודד על ידי גן יחיד) • יש תכונות שבהן מעורבים מספר גנים. • ביטויין של תכונות כמו גובה ומשקל, מושפע משילוב בין גנים וגורמים סביבתיים.
לא כל ה – DNA של התא מורכב מגנים • ישנם קטעים שאינם מקודדים לחלבונים ואינם משחקים תפקיד ידוע בבקרה על פעילות הגנים. • בפרוקריוטים קטעים אלה קצרים. • בגנום האדם מהווים כ – 97% מכלל ה - DNA
המטען התורשתי של מין מסויים יכול להשתנות במספר דרכים • רקומבינציה: בתהליך הרקומבינציה נוצרים צרופים חדשים בין קטעי DNA קיימים. תהליך זה מתרחש למשל במהלך יצירת תאי הרבייה (מיוזה). כאשר נגיפים חודרים לתא, המטען התורשתי שלהם משתלב במטען התורשתי של התא בתהליך רקומבינציה. • מוטציה: מוטציה היא שינוי בנוקלאוטיד אחד או יותר ברצף ה DNA. מוטציה יכולה לגרום לשינוי ברצף ה – RNA שליח, שעשוי לגרום לשינוי ברצף חומצות האמיניות של החלבון ויתכן אף לשינוי במבנה המרחבי של החלבון, עד כדי אובדן פעילותו או רכישת פעילות שונה.
תעתוק במהופך • ישנם נגיפים שהמטען התורשתי שלהם מורכב מ – RNA. • עם כניסתם לתא המאכסן, ה – RNA עובר תעתוק הפוך למולקולת DNA על ידי אנזים מיוחד המכונה אנזים מתעתק במהופך. • למשל, זאת דרך פעולתו של נגיף ה – HIV שגורם לאיידס: מולקולת ה – DNA שתועתקה במהופך משתלבת בתוך ה – DNAשל התא והופכת את הנדבק לנשא של גנום הנגיף. • חוקרים משתמשים באנזים המתעתק במהופך על מנת ליצור במבחנה מולקולת DNA לפי התבנית של מולקולות RNA.
העכבר (הימני) הזוהר שנוצר על ידי שילוב הגן המקודד לחלבון GFB שמקורו במדוזה, בגנום שלו. העכבר השמאלי משמש להשוואה.
מהו מנגנון הבקרה לביטוי הגנים? • בכל גן אפשר להגדיר שני סוגים של אזורים בעלי תפקיד שונה: • אזורים מבניים – אזורים המקודדים לחלבון. מהם מתועתק ה – RNA שליח ובהמשך תורגם החלבון. • אזורי בקרה - אזורים האחראים על הבקרה של ביטוי הגן. ביניהם ישנם אזורי בקרה המסמנים את התחלת התעתוק של הגן ואזור המסמן את סיום התעתוק.
בפרוקריוטים • מספר גנים יכולים להיות מאורגנים תחת בקרה משותפת שלא אזור בקרה הנמצא בסמוך לאזור המבני. • יחידת ארגון זאת, המכונה אופרון, כוללת בדרך כלל גנים המעורבים בתהליך משותף (למשל, כולם מקודדים לאנזימים המעורבים ביצירת חומצה אמינית מסוימת) והם מתבטאיםביחד. • הבקרה של ביטוי האופרון נעשית על ידי חלבוני בקרה, המתקשרים לרצפים שונים באזור הבקרה ופועלים כמעכבים או מפעילים של תהליך התעתוק.
בקרה על ביטוי גנים בפרוקריוטיים – האיור מתאר אופרון המורכב משלושה גנים ואזור בקרה
באיקריוטים • כל גן מבוקר בנפרד על ידימספר אזורי בקרה. • חלק מאזורי הבקרה יכולים להימצא במרחק רב מהגן שהם מווסתים או אף בתוך הגן עצמו, באזורים שעוברים עריכה לאחר התעתוק. • הבקרה של הגנים האיקריוטיםמורכבת יותר מהבקרה בפרוקריוטים ומעורבים בה מספר רב יותר של חלבוני בקרה. • אלה הם חלבונים הנקשרים לרצפים ייחודים באזורי הבקרה או זה לזה ובצורה זאת מעכבים או מגבירים את תעתוק הגן. • מגוון חלבוני הבקרה משתנה בסוגים שונים של תאים, בשלבים שונים בהתפתחות העוברית ובהשפעת גורמים סביבתיים או פנימיים. השינוי במגוון של חלבוני הבקרה גורם לביטוי של גנים שונים.
בקרה על ביטוי גנים באוקריוטיים – האיור מתאר גן המורכב מאזור מבני ואזור בקרה. היום נהוג להגדיר לגן (הגדרה רחבה יותר - שקופית 5)
סיפור מקרה: הורמון הגדילה מאדם נוצר בחיידקים
מידע - • הורמון הגדילה הוא חלבון קצר 191 חומצות אמיניות. • מופרש מההיפופיזה לזרם הדם. • משפיע על גדילת העצמות הארוכות של הגוף, בניית מסת השריר ועל חילוף החומרים בתאים. • פגמים בהיפופיזה – גורמים לעיכוב יצירת ההורמון. • העדר ההורמון מתבטא בננסות שבה הפרופורציות בין אברי הגוף הן נכונות, אבל הילדים נמוכים יחסית לבני גילם. • פתרונות – • הורמון הגדילה המופק מבעלי חיים אינו יעיל באדם. • כמות ההורמון המופק מנפטרים – נמוכה. • החומר המופק עלול להעביר למטופל מחלות (מחלה ניוונית של המוח)
טכנולוגית ההנדסה הגנטית, איפשרה בראשית שנות השמונים ייצור של הורמון גדילה של אדם על ידי הכנסת הגן מאדם לחיידקים. • השלבים העיקריים בתהליך הם: • בידוד הגן מגנום האדם או יצירת גן משלים. • חיבור הגן לפלסמיד שמשמש כנשא. • הכנסת הגן המהונדס על גבי הפלסמיד לתאי חיידקים. • ביטוי הגן בחיידקים. • גידול החיידקים בכמויות גדולות והפקת ההורמון.
בידוד הגן המקודד להורמון הגדילה באדם. • הגן (כמו רוב הגנים באיקריוטים) מכיל אזורים שעוברים עריכה לאחר שלב התעתוק ואינם משתתפים בבניית החלבון עצמו. • היות ומעוניינים שהגן יתבטא בחיידקים, שבהם לא מתבצע תהליך העריכה של ה – RNA השליח, יש להכניס לחיידקים רק את קטעי הגן שעוברים תרגום. • עושים זאת בדרך הבאה:
מבודדים מולקולות RNA שליח שמקודד להורמון הגדילה. מולקולות אלו עברו עריכה ושחבור, ולכן מכילות רק רצפים שיעברו תרגום. לצורך הפקת כמות גדולה של RNA שליח משתמשים ברקמת גידול סרטני של ההיפופיזה המפרישה את הורמון הגדילה ברמה מאוד גבוהה. • במבחנה, בעזרת האנזים המתעתק במהופך, יוצרים מולקולות DNA משלים, לפי התבנית של ה – RNA שליח. ה – DNA המשלים שנוצר מכיל את כל הרצפים שמתורגמים להורמון הגדילה. יצירת DNA משלים בעזרת האנזים המתעתק במהופך.
חיבור גן לנשא • על מנת להכניס את הגן מקודד להורמון הגדילה ש לחבר אותו לנשא מתאים שיאפשר את שכפולו במספר רב של עותקים. • פלסמידים נחשבים לנשאים מתאימים. • פלסמידים הם מולקולות של DNA מעגלי, המתרבות בתא החיידק באופן עצמאי. • הם מכילים גנים המקודדים לעמידות לאנטיביוטיקה. • הם מתרבים במהירות בתוך תא החיידק ומספרם יכול להגיע למאות עותקים בתוך התא.
תחילה יש לחתוך את המולקולה המעגלית של הפלסמיד, כדי לחבר אליה את הגן. • למטרה זו משתמשים באנזימי הגבלה (תפקידם המקורי לפרק את החומר התורשתי של נגיפים הפולשים לתוך תא החיידק. • החיתוך המתבצע על ידי אנזימי ההגבלה הוא ייחודי – כל סוג של אנזים הגבלה חותך את ה – DNA אך ורק ברצף נוקלאוטידי ייחודי, שאורכו 4-8 נוקליאוטידים.
אנזים הגבלה מזהה רצף ייחודי וחותך את ה – DNA לתוצרי החיתוך קצוות קצרים של DNA חד גדילי. באיור – חיתוך עם אנזים ההגבלה Eco R1
על מנת שהגן שמקורו באדם יוכל להתבטא בחיידקים, הוא צריך להכיל אזור בקרה המוכר על ידי האנזים המתעתק ה – RNA פולימרז וחלבוני הבקרה של החיידק. לכן, יש לחבר לפלסמיד, המשמש כנשא, גם אזור בקרה שיאפשר את תעתוק הגן בחיידק. פלסמיד מהונדס – פלסמיד הנושא גן מהונדס המקודד להורמון הגדילה, ויכול להתבטא בתאי החיידק.
הכנסת הנשא לתוך החיידק • חיידקים קולטים מולקולת DNA מתוך המצע בו הם נמצאים בתהליך הנקרא טרנספורמציה. • חלק קטן מהחיידקים יקלטו את הפלסמיד המהונדס. • יש לבודד את החיידקים שקלטו את הנשא.
האפשרויות לבידוד החיידקים נושאי הפלסמידים המהונדסים • שימוש בגן מדווח לזיהוי מושבות שעברו טרנספורמציה. • גן מדווח יוצר תוצר שקל לזהותו, כמו למשל צבע או זהירה (אור). • אם מחברים את הגן המדווח לנשא המהונדס – רק החיידקים שמכילים את הנשא המהונדס יהיו בעלי צבע או זהירה.
2. שימוש בגן בורר לזיהוי מושבות שעברו טרנספורמציה גן בורר מאפשר לברור מכלל החיידקים את החיידקים שקלטו את הנשא המהונדס. בדרך כלל משתמשים בגן המקנה עמידות לאנטביוטיקה, אותו מחברים לנשא המהונדס. זורעים את החיידקים שבתערובת על מצע מוצק עם אנטיביוטיקה מתאימה. שורדים רק החיידקים שעברו טרנספורמציה ורכשו את הגן לעמידות.
גידול חיידקים - חיידקים מתרבים ברבייה אל מינית. זמן הדור של E.Coli 20 ד'. במהלך גידול החיידקים, גם הפלסמידים מתרבים בתוכם. התרבות הפלסמיד בתוך החיידק אינה תלויה בהתחלקות תא החיידק ולכן נוצרים בחיידק עותקים רבים של פלסמידים, מחיידק בודד, שקלט מולקולה אחת של נשא מהונדס עם הגן של הורמון הגדילה, אפשר לקבל תוך מספר שעות מיליוני עותקים זהים של הגן. לתהליך הזה קוראים גם שיבוט DNA – שבט זהה של ולקולת DNA
סיכום תהליך השיבוט של הורמון הגדילה מאדם בחיידקים זיהוי החיידקים שעברו טרנספורמציה בעזרת גן מדווח או גן בורר
בדיקת הביטוי של הגן • בדיקה ברמת ה – RNA השליח: מפרקים חלק מהחיידקים ומגיבים את ה – RNA שבתאיהם עם גלאי ייחודי שיוצר תגובת צבע. (הגלאי מכיל קטע DNA או RNA בעל רצף משלים לרצף של ה – RNA השליח של הורמון הגדילה. אם אכן ה – RNA השליח הזה נוצר בתאים, הגלאי ייצמד אליו באופן ייחודי ותופיע תגובת צבע. – הגן עבר תעתוק בתאי החיידק. • בדיקה ברמת החלבון: אם הגן מתבטא, יווצר חלבון, הוא הורמון הגדילה, אפשר לזהותו בעזרת גלאי הנקשרים לחלבון באופן ייחודי ויוצרים תגובת צבע. גלאים אלה מכילים נוגדנים הנקשרים לאתרים ייחודים בחלבון. הופעת צבע תצביע על נוכחות החלבון.
תרביות תאים אנימליים אפשר לבודד תאים מתוך רקמה ולגדלם במנותק מהגוף בתרבית תאים. ישנם תאים שקצב התרבותם גבוה ותאים אחרים (תאי עצב) שבלתי אפשרי ליצור מהם תרבית תאים. את תרבית התאים מגדלים באינקובטור – בו התנאים סטריליים והטמפ', הלחות, ההרכב גזים מבוקרים. ב. תאים בתרבית יוצרים שכבה על קרגעית צלחת ממצע מזון נוזלי ג. תאי CHO הגדלים בתרבית (חלבוני שלד התא והגרעין נצבעו עם נוגדנים זוהרים) א. עבודה במנדף סטרילי
הכנסת גנים לתוך תאים אנימליים היום מקובלות מספר שיטות להכנסת גנים תלוך תאים אנימליים: • טיפול כימי ב – DNA שמעוניינים להחדיר לתא – טרנספקציה. • הזרקה לתוך תאים באמצעות מחט בעלת קוטר מיקרוסקופי. • הפעלת שדה חשמלי המשנה את תכונות החדירות של קרום התא ומאפשר קליטת DNA מהתמיסה - אלקטרופורציה. • שימוש בנגיפים.
