凋亡相关基因－ Bax 在不同细胞中表达产物差异检测

凋亡相关基因－Bax在不同细胞中表达产物差异检测凋亡相关基因－Bax在不同细胞中表达产物差异检测细胞损伤与保护实验（三）

原理 免疫细胞化学（免疫组化）是将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有的特殊标记物的显示，籍以对细胞内某抗原或抗体作定性、定位以及定量检测。亲和组织化学：则将一些具有双价或多价结合力的物质(生物素)，应用于免疫组化，使得抗原抗体的亲和力比免疫组化高出100万倍。其更具高灵敏性和高特异性。

原理 Bax—— • 凋亡相关基因 • Bcl-2家族成员 • 细胞损伤时其蛋白构象发生改变（寡聚化） • 作用线粒体膜，使其膜通透性增加，释放Cytc，细胞凋亡

原理 本次实验以Bax构象蛋白为抗原，用小鼠特异性抗体（一抗）与其结合，再用生物素标记的羊抗小鼠抗体（二抗）与前者结合，形成了生物素复合物。此复合物与SABC作用，使得检测物被放大，最后在显色剂DAB的作用下，Bax构象蛋白显色（褐色）。

器材与试剂 仪器：移液枪、枪头、滴管、显微镜材料：培养细胞试剂：甲醇、PBS、封闭液、一抗、二抗、 SABC、DAB 、0.3％H2O2-PBS、

试剂说明 • PBS：磷酸盐缓冲液（ 0.01M pH7.4 ） • 封闭液：山羊血清(或BSA)，用时PBS稀释 • 一抗：小鼠IgG，用时PBS稀释 • 二抗：生物素标记的羊抗小鼠IgG • 0.3％ H2O2-PBS（甲醇）消除内源性过氧化物酶活性作用 • SABC (avidin-biotin-peroxidase complex 链酶亲和素 ——生物素——过氧化物酶复合物) ：抗生物素，起到放大作用 • DAB(diaminobenzidine)显色液： 3,3´-二氨基联苯胺

实验步骤 • 培养细胞（96孔板，每组3正常、3损伤、3损伤恢复） • PBS洗，5min X 3次 (轻轻地洗涤) • 甲醇固定10min • PBS洗，5min X 3次 • 加入封闭液（1:10）25µl，37 ℃，30min • 加一抗（1:300）25µl，37℃，1h (或4℃过夜) • PBS洗，5min X 3次 • 加二抗（1ml PBS加入生物素化山羊抗小鼠IgG 10µl）25µl，37 ℃，1h • PBS洗，5min X 3次

实验步骤 • 加0.3％ H2O2-PBS（甲醇），37 ℃，30min • PBS洗，5min X 3次 • SABC工作液（1ml PBS加入SABC 10µl，混匀）20-30µl，37 ℃，1h • PBS洗，5min X 3次 • DAB显色： DAB显色工作液配制（现配）：1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后加至细胞孔板，镜下控制，以蒸馏水终止反应。 • 观察结果

实验结果 缺糖前 Hela细胞

缺糖 24h Hela细胞

缺糖 48h Hela细胞

缺糖前 PC 12细胞

缺糖 24 hPC 12细胞

缺糖 48 hPC 12细胞

注意事项 • 一、二抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。 • 染色背景过高，在DAB显色之前，用含0.01-0.02％TWEEN20的PBS洗涤标本4次，再PBS洗2次，然后DAB显色。 DAB有毒性（小心） • SABC试剂盒保存在4 ℃为佳(2年)，而-20 ℃短期内生物活性则被破坏。 • 购试剂盒时注意厂家批号，其差异很大，会影响稳定性。

告知 实验（四） • 细胞内微核的检测 • 家系分析

凋亡相关基因－ Bax 在不同细胞中表达产物差异检测

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