1 / 59

Současné trendy v klinické imunologii a sérologii

Současné trendy v klinické imunologii a sérologii. JAN MARTINEK. OSNOVA. Základní principy metod v imunologii a sérologii Imunoglobuliny Problematika infekční sérologie (vybrané infekční agens). Principy metod v imunologie a sérologii - DĚLENÍ METOD. Humorální Buněčné.

mahala
Download Presentation

Současné trendy v klinické imunologii a sérologii

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Současné trendy v klinické imunologii a sérologii JAN MARTINEK

  2. OSNOVA Základní principy metod v imunologii a sérologii Imunoglobuliny Problematika infekční sérologie (vybrané infekční agens)

  3. Principy metod v imunologie a sérologii - DĚLENÍ METOD Humorální Buněčné

  4. Metody nefelometrie a turbidimetrie • Stanovení: proteiny akutní fáze, složky komplementu, podtřídy IgG • Princip: měření intenzity světla • precipitace v roztoku – přímé měření množství precipitátu - zákal • kvantitativní stanovení (kalibrační křivka)

  5. Elektroforéza • Stanovení: Orientační informace o změnách v kvantitativním zastoupení jednotlivých frakcí imunoglobulínů - především • Princip: Proteiny mají el. nábojpodlenáboje se rozdělí v elektrickém poli(albumin, , , - frakce). • možnost denzitometrické kvantifikace

  6. E L E K T R O F O R É Z A

  7. I MUNOFIXACE

  8. Metody – EIA • Stanovení: infekční sérologie, autoprotilátky, tumor. Markery, spec. IgE … • Princip: Specifická interakce mezi antigenu a protilátky s následným stanovením • Typy: ELISA, FEIA, ELISPOT, CLIA, , CLIA, ECLIA, MEIA …

  9. Metoda – ELISA Princip: • komplex Ag - Ab detekován sekundární protilátkou značenou enzymem (křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza) • komplex Ag – Ab je vázán na imunosorbent, nenavázané Ag (Ab) se odstraní promytím • vysoká citlivost (1ng/l)

  10. ELISA – průkazantigenu

  11. TYPICKÝ VÝSLEDEK STANOVENÍ SPECIFICKÝCH PROTILÁTEK TECHNIKOU ELISA

  12. METODA CLIA – ADVIA CENTAUR

  13. Metoda – WB, Imunodot • Stanovení: Infekčních, autoimunitních, spec. IgE …

  14. WESTERN BLOT (IMUNOBLOT)

  15. Metoda – IFA • Stanovení: Především autoimunitních parametrů a dále infekční agens

  16. NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE

  17. Autoprotilátky na HEp-2 buňkách : Antigeny asociované s dělením buňky centriola dělící vřeténko separační zóna buňky Jaderné autoantigeny polynukleotidy histony ribonukleoproteiny antigeny jadérek centroméra další antigeny Orgánově nespecifické antigeny cytoplazmy buněčné organely antigeny cytoskeletu další antigeny

  18. Komplement fixace a hemaglutinace • komplement-fixační reakce je založena na vyvazování komplementu z reakčních směsí specifickými komplexy Ag s Ab – spotřeba komplementu. V druhém kroku je stanovena hemolytická aktivita komplementu (nepřítomnost protilátky se projeví lýzou). Testem jsou prokazovány směsné protilátky (nelze samostatně prokázat např. IgM). • aglutinace na nosičích je precipitace převedená na aglutinaci , nejčastěji latexová aglutinace nebo pasivní hemaglutinace (HA). Všechny typy aglutinace na nosičích jsou vysoce citlivými reakcemi k důkazu protilátek.

  19. NEPŘÍMÁ HEMAGLUTINACE

  20. Testy Buněčné imunity Funkční testy leukocytů Stanovení počtu buněk

  21. Funkční testy Fagocytosa – od metod diagnostikovaným pod mikroskopem až po aplikace na průtokovým cytometrem Fagocytosa aplikace průtoková cytometrie – využití principu, že při fagocytoze vznikají kyslíkové radikály → oxidace dihydrorodaminu na rodamin (fluorescence)

  22. Funkční testy Basotest Aktivita NK buněk Blastická transformace lymfocytů

  23. Stanovení počtu Význam: především diagnostika imunodeficitů a leukemií

  24. PRŮTOKOVÁCYTOMETRIE • vrchol současných možností analýzy • buněčných suspenzí • částice jsou v laminárním proudění usměrněny do řady • cytometrie určuje: • - počet • - velikost (FS) • -„morfologii“ buněk (SS) • - přítomnost fluorescenčního signálu (FL) • údaje získané pro jednotlivé buňky • jsou vyhodnoceny počítačem

  25. Fluorochrom je konjugován s primární protilátkou

  26. Vyjadřování výsledků - EIA metody • Index pozitivity – Cut off (referenční sérum) 0-0,9 – negativní 0,9-1,1 – hraniční >1,1 - pozitivní • Kalibrační křivka – standardy

  27. Vyjadřování výsledků - IFA metody Subjektivní hodnocení, komentář • Hraniční • Slabě pozitivní • Pozitivní • Silně pozitivní

  28. Vyjadřování výsledků – metody WB, Imunodot Semikvantitativní hodnocení, komentář • Subjektivní hodnocení v kombinaci se software

  29. Vyjadřování výsledků – průtoková cytometrie • Procentuální vyjádření jednotlivých subpopulací s návazností na hematologické parametry (Le, Ly) • U hematologických pacientů komentář

  30. MULTIPLEXY V širším slova smyslu, jakákoliv metody, kdy stanovujeme najednou (reakční prostor) více parametrů, př. „linedot“ Dnes spojeno s tzv. „microarray“ – stanovení genové exprese, proteinového profilu, ne v rutinním provozu

  31. „Kuličkové“ Multiplexy Směs „kuliček“ různé velikosti a barvy potažené antigeny Detekce jakýchkoli protilátek Není zatím v rutinní praxi

  32. IMUNOGLOBULINY A B-LYMFOCYTY

  33. Hemopoéza

  34. BCR receptor, Imunoglobuliny

  35. S S S S S S S S S S VH DH JH Cm C C C 4 C1 C 3 C 2 C 1 C 2 C  Lokalizace genu v genomu: GENETICKÁ ORGANIZACE IgH Těžký řetězec – 14 chromozom Lehký řetězec – λ – 2 chromozom k – 22 chromozom

  36. Schéma přepis IgH genu (k,l,autoreaktivita)

  37. Diferenciace B-lymfocytů Diferenciace na antigenu nezávislá – v KD, změna membránové výbavy, přeskupení genu pro receptor Diferenciace na antigenu závislá – sekundární lymfatické orgány, somatická mutace (změny v genu BCR v přítomnosti antigenu, selekce klonu), izotypový přesmyk

  38. CHARAKTERISTIKA PROTILÁTEK

  39. DYNAMIKA PRIMÁRNÍ A SEKUNDÁRNÍ PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI

  40. ONTOGENETICKÁ DYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI

  41. LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA INFEKČNÍCH NEMOCÍ: PŘÍMÝ PRŮKAZ MIKROORGANISMU NEBO JEHO PRODUKTU kultivace mikroskopie PCR

  42. NEPŘÍMÝ (SÉROLOGICKÝ) PRŮKAZ • Stanovení protilátek • obtížně kultivovatelné bakterie (lues, borelie aj.) • retrospektivní nález (epidemiologie) • Dynamika protilátkové odpovědi IgG x IgM

  43. IgG IgM Množství protilátek IgA čas DYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI

  44. EBV

  45. Souhrn - EBV • Čeleď Herpesviridae, DNA virus • Kosmopolitně • Rozvojové země – v dětství, západní země – až adolescence • Celoživotní nosičství (latentní infekce organismu) - perzistence v organismu, brána vstupu: buňky nosohltanu, latentní infekce lymfocytů B (transformace v permanentní buněčné linie)

  46. EBV - Protilátky • Neoantigeny – produkce heterofilních protilátek – Paul-Bunnell, Ericsonův test • Nalezáme protilátky proti- VCA, EBNA, EA

  47. Dynamika tvorby protilátek

More Related