Definování proteomu

1. Definování proteomu Znalost úplné genetické informace organismu (genomu), získaná sekvencováním DNA a určením funkce jednotlivých genů umožňuje hlouběji proniknout do molekulové podstaty funkce živých organismů. Cílem rozluštit genom se zabývá vědní odvětví zvané genomika. Genetická informace ale hovoří pouze o dědičně převzatých schopnostech organismu. K realizaci životních funkcí organismu je nutné na podkladu genů vytvářet proteiny. Tento děj je podléhá regulaci zavisející na mnoha vnitřních i vnějších faktorech. Pro soubor všech buněčných proteinů se od 1995 (Wilkins) ujal pojem proteom jako komplementární soubor proteinů k souboru genů (genomu). PROTeins expressed by agenOME.

2. Pojem proteom vystihuje souhrn všech proteinů, které jsou kódované a exprimované v buňce (či viru) spolu s jejich interakcí (proteinové komplexy) a funkčními vztahy (tzv. specifické souvislosti). Jiná definice říká, že jde o okamžitý soubor všech proteinů ve vzorku (buňka, tkáň) - tedy v určitém čase. Obdobně třeba lipidom, lipidomika.

3. Lokalizace a funkce proteinových komplexů (PK)

4. Proteinové komplexy a jejich hyperspojení nebo Jádro proteomu (konstelace stabilních PK a volných proteinů) nad to: přesahové interakce,regulátorové proteiny, buněčně specifické modifikace

5. Proteomika Zatímco genom je pojmem jednoznačně statickým, v podstatě konstantním, proteom je pojmem dynamickým. Koncentrace proteinů se totiž neustále mění podle aktuálních potřeb organismu (na rozdíl od genové výbavy). Studiem proteomu se zabývá vědní odvětví na rozhraní Bi-Ch, proteomika. Cílem je komplexní analýza proteinů organely, buňky, tkáně či extracelulárních tekutin. Na počátku takové analýzy vždy stojí separace složité směsi proteinů v extraktech elektro-foretickými metodami. V tomto směru největší potenciál má 2-D elektroforéza (ale i obě dimenze jednotlivě, dle potřeby). Získá se takto tzv. proteinová mapa. Proteiny z proteinové mapy jsou pak identifikovány na základě obecného postupu 1. Edmanova sekvenční analýza nebo MS, 2. vyhledávání v dtb.

7. CIBULOVÝ MODEL BIOLOGICKÉHO VÝZKUMU

8. 2D elektroforéza Kombinuje použití IEF a SDS-PAGE pro účely studia proteomu. vypracováno O´Farrellem v 70. letech, dnes do značné míry polo- automatizovaná rutinní záležitost. Dodnes nepřekonaná komplexní elektroforetická separace proteinů. Směs proteinů nejprve separována IEF v přítomnosti močoviny, a to buď v trubičkovém gelu nebo na tzv. stripu plochého gelu. Následně je IEF gel přenesen na plochý gel pro SDS-PAGE a elektroforéza proběhne ve směru 2. dimenze (90o vůči 1. dimenzi). Dnes se používá komerčních gelů pro obě dimenze, dosti drahá záležitost. Rutinně lze takto separovat 1000 - 2000 proteinů v závislosti na formátu gelu.

10. 2D elektroforéza je důležitá pro analýzu proteinů v totálních buněčných extraktech. Na 2D elektroforéze a následné sekvenční analýze proteinů je postavena proteomika jako jedno z rozvíjejících se odvětví life sciences. Jak bylo řečeno proteom vystihuje souhrn všech proteinů, které jsou kódované a exprimované v buňce (či viru) spolu s jejich interakcí a funkčními vztahy (tzv. specifické souvislosti). Analýza proteomu začíná separací proteinů v extraktech 2D elektroforézou; následuje počítačová „image analysis“ gelu, při které se například ověřují změny v poloze tzv. spotů příslušejících určitým proteinům, ke kterým dochází na základě přirozených nebo uměle vyvolaných změn v buňce. Lze tak například porovnávat standardní organismy („wild type“) s mutanty, vyšlechtěné odrůdy, hodnotit vliv stresu.

13. Identifikace proteinů v proteomice Molekulovou hmotnost nativního proteinu separovaného ELFO lze potvrdit hmotovou spektroskopií MALDI TOF, ESI TOF. Sekvenční analýza se provádí způsoby: 1.Edmanovou degradací (přímé sekvencování) a 2.hmotovou spektrometrií (nepřímé sekvencování, fingerprinting, „de novo“ sekvencování). V obou případech pak na základě získaných sekvencí následuje hledání v databázích proteinů Pro přímé sekvencování je nutný blotting nativního proteinu nebo jeho peptidových fragmentů (připravených in-solution štěpením a následně separovaných ELFO Schäger/von Jagow) na PVDF membránu. Po obarvení membrány amidočerní 10B se vyříznou příslušné pásy (1D) nebo skvrny (2D) a fragmenty membrány se vloží do reakční cely proteinového sekvenátoru.

14. coupling cleavage conversion

15. Detailně průběh 3 x C

16. Auromatizace

17. Po odštěpení PTC-derivátu následuje jeho analýza (zjištění retenčního času na HPLC koloně) s detekcí při 270 nm. Běžně je takto možné získat 30 - 40 aminokyselin z N-konce, samozřejmě s narůstající chybou (reakce není 100% ní). Za ideálních posmínek maximálně 100 aminokyselin. V automatickém proteinovém sekvenátoru (dodávají např. firmy Applied Biosystems, Shimadzu) je analyzovaný protein či peptid imobilizován. Buď na disku ze skleněných vláken (kovalentní vazba nebo adsorpce) nebo na membráně PVDF (ProSorb patrony nebo po blottingu). Reagencie ke vzorku vstupují a jsou odváděny nejlépe v plynné fázi. Doba trvání jednoho cyklu analýzy činí 30-60 min. Je třeba připočítat eluci standardů aminokyselin a tzv. prázdný run.

18. Pro analýzu Edmanovou degradací jsou nutná množství vzorku 20-50 pmol, nejlépe však 200 pmol, konkurenční MS nyní zvládá fmoly (nanosprej ESI Qq TOF MS), dosud však není tolik rozšířená. Podmínkou pro úspěšnou sekvenční analýzu Edmanovou cestou je volný N-konec peptidu či proteinu. Často je však N-konec chemicky blokován (acetylace, pyroglutamová kyselina). Nevýhodou i výskyt glykosylačních míst - zde nízký výtěžek v daném cyklu. V praxi se blokace dá obejít analýzou vnitřních (interních) peptidů (viz dále), nebo chemickou či enzymovou (pyro-glutaminpeptidasa) deblokací a enzymovou deglykosylací.

20. Hmotnostní (hmotová) spektrometrie mass spectometry, MS Je metoda pro separaci látek podle rozdílů hmoty (m) a náboje (z) s využitím elektrického a magnetického pole. Určovanou fyzikální veličinou je podíl hmoty a náboje (m/z), při znalosti náboje umožňuje určit molekulovou hmotnost. Velmi citlivá metoda, stačí několik iontů k získání měřitelného signálu, poměr m/z může být stanoven s přesností 10-4. Původně aplikována pro malé těkavé látky, či derivatizované netěkavé látky (ionizace paprskem elektronů - EI, chemická ionizace s nosným plynem). S objevem šetrnějších technik ionizace (ESI, MALDI) je možné měřit i velké molekuly (např. proteiny, lipidové komplexy, polysacharidy).

21. Biochemické aplikace hmotové spektrometrie Velký rozvoj přístrojů a metod pro MS v poslední dekádě dramaticky zvýšiluplatnění metody pro výzkum v biochemii. Jde o studium biomakromolekul a jejich konglomerátů zaměřený převážně na proteiny. LC-MS se používá pro peptidové mapování, studium disulfidových vazeb v proteinech (srovnání mapy intaktního a redukovaného proteinu). MS se stala jedním z článků studia proteomu. Proteomová analýza (nejčastěji s MALDI TOF MS) často navazuje na laboratorní studium exprese genů, zvláště při genových manipulacích: identifikace rekombinantních proteinů, posouzení mikroheterogenity, posttranslační modifikace.

22. Electrospray ionisation (ESI) Při této metodě je vzorek rozpuštěn v těkavém rozpouštědle a rozprašován pomocí nabité mikrostříkačky (kovová, skleněná s kov. pístem - Hamilton). Vzniká tak aerosol drobných kapiček, který je vysoušen proudem suchého dusíku. Jak klesá velikost kapičky, roste hustota náboje. Dojde k tzv. kulombické explozi, při které se uvolní ionty, které odchází do spektrometru. Podobně jako u techniky MALDI (viz dále), vzorek je disintegrován na jednotlivé molekuly a ionizován při těch nejjemnějších podmínkách. Videálním případě by vzorek měl být rozpuštěn v čistém rozpouštědle, u reálných vzorků biomakromolekul je někdy nutné zachovat pufry kvůli stabilitě, musí ale být velmi zředěné. U ESI je velmi výhodné použití např. uhličitanu amonného, HAc, HCOOH. Ionty z jiných pufrů mohou ve spektru interferovat se studovanou látkou.

23. Electrospray ionisation (ESI) v proteomice uspořádání „nanospray“ - malé objemy vzorku

24. Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) Laserová desorpční ionizace s pomocí matrice Metoda MALDI MS (od 1988) je rozšířeným nástrojem pro separaci přírodních látek, peptidů, proteinů a dalších bio-makromolekul (oligonukleotidy, sacharidy, lipidy). Vzorek je na nerezové destičce ukotven v netěkavé matrici (kokrystalizace). Používá se např. kyselina nikotinová nebo 2,5-dihydroxybenzoová. Vzorek (1 mg/mL) se nanese v množství 0.5 ml na nerezovou destičku a nechá se vysušit. Pak se aplikuje 0.5 ml matrice a opět se nechá vysušit. Matrice se volí dle vzorku, účelem použití je desorpce energie laseru. Destička se vloží do přístroje, zacílí se laserový paprsek („fire“), transfer energie způsobí ionizaci. Směrovaný energetický impuls poskytuje vysoké výtěžky iontů intaktního analytu, dosahuje se subpikomolární sensitivity.

25. MALDI

26. DE (delayed extraction) - ionty se okamžitě po ionizaci ochladí (~150 ns), tím se sníží distribuce kinetické energie (ionty se stejnou hodnotou m/z mají různou kinetickou energii). Použití pro látky pod 30 kDa.

27. Některé používané matrice Dodáním energie dojde k odpaření matrice, která se nachází v nadbytku; v plynné fázi pak matrice nese analyt. Analyt je tak převeden do plynné fáze nepřímo. Matrice je zároveň donorem či akceptorem protonu, podle modu ionizace. Vůbec první byla kyselina nikotinová.

28. Schéma hmotového spektrometru

29. MS je často propojena s jinými analytickými technikami, ať už separačními nebo bez separace. Vznikají tak systémy GC-MS, LC-MS, CE-MS ale i MS-MS. Kromě tandemové MS (MS-MS) mohou být spojeny až tři i více analyzátorů („multiple“ MS). První vybírá studované látky ze směsi, druhý je fragmentuje, třetí analyzuje vzniklé fragmenty. Pro identifikaci látek ve složitých směsích; nikoli na základě m/z, ale podle fragmentačních obrazů („patterns“). Ve spojení s chromato či elfo metodou slouží MS jako detektor s vysokým rozlišením. Taková on-line analýza pak dává okamžité výsledky na rozdíl od off-line detekce. Klíčové je propojení přístrojů. LC-MS v biochemii pro peptidy a proteiny, GC-MS pro těkavé LMW látky, CE-MS široký záběr od LMW po proteiny, DNA, viry etc.

30. Analýza iontů uvolněných ionizací - používané analyzátory 1. Double focusing magnetic sector analyser (analyzátor s dvojím zaostřením) - nejdříve elektrostatická separace podle náboje, následuje separace v magnetickém poli podle hmoty. Výsledkem je tedy separace podle poměru m/z. Elektrické pole: z.e.U = mv2/2 Magnetické pole: B.z.e.v = mv2/r odtud: m/z = (B.r2.e)/2U část: magnetický analyzátor

31. 2. Quadrupole mass analyser (kvadrupólový analyzátor) - dva páry paralelních tyčí po stranách iontového paprsku. Změnou stejnosměrného napětí (DC) přiváděného současně s radiofrekvenčním (RF) napětím je možné vybrat látky s určitou hodnotou m/z. zbytek iontů není detekován

32. 2a. Quadrupole ion trap IT má velikost tenisového míčku, tři hyperbolické elektrody - prstenec a dvě koncové čepičky. Ionty z ionizátoru jsou zaostřeny do iontové pasti plněné heliem. Díky napěťovým pulsům je IT otevřena (-V) nebo zavřena (+V). Diskontinuální průchod iontů. oscilační napětí

33. 3. linear TOF analyser („time of flight“, přeletový) - ionty jsou urychlovány v lineární trubici, bez magnetického pole. Hodnota poměru m/z může být určena z času, který je nutný pro překonání trubice v délce L. TOF analýza se zvláště využívá pro ionizační techniky, které poskytují ionty diskont. (MALDI). 4.TOF reflectron (iontový odražeč, zrcadlo) - kombinace TOF s elektrostatickým analyzátorem, reflektronem. Čas letu je prodloužen, klesá distribuce kinetické energie, tím i časová distribuce (snižuje se šířka píku). Tím se zvyšuje rozlišení. Omezení, vhodné pro m/z menší než 10,000. 5.Fourier transform ion cyclotron resonanceanalyzer (FT ICR) - částice rotují v magnetickém poli, působením rezonanční radiové frekvence jsou excitovány a tím pádem vzniká proud. Ten může být matematicky transformován, získají se frekvence komponent, které jsou ve vztahu k jejich m/z.

34. akcelerace v el. poli: z.e.U = mv2/2 doba letu: t = L/v = L . sqrt (m/2.z.U) m/z = (2. U .t2)/L2

35. Triple quadrupole mass spectrometer (QqQ) MS/MS v jednom přístroji Q1, filtrace iontů, typický kvadrupólový analyzátor; výběr iontů pro vstup do druhého kvadrupólu q2, neslouží k separaci iontů (fixní RF napětí) - „tunel“, použití jako kolizní cela pro fragmentaci iontů (kolizní plyn, el. pole) Q3, druhá filtrace iontů vycházejících z q2 (u Q TRAP MS instrumentů má funkci lineární iontové pasti) nahrazením Q3 TOF analyzátorem vzniká Qq TOF (QSTAR)

36. Q0 Q1 q2 ESI Qq TOF instrument

37. MALDI TOF/TOF Nejnovější MS/MS přístroj s MALDI ionizací, konkurent pro ESI Qq TOF a ESI Q TRAP. Kolizní kvadrupól nahrazen TOFem s kolizí (target gas), analýza kolmým TOF analyzátorem s reflektronem 4700 Proteomics Analyzer, Applied Biosystems

38. Electron multiplier - detektor Tvar rohu, aplikuje se vysoké napětí, opačně vůči iontům, které mají být detekovány (nejč. -V). Kolizemi s povrchem EM se tvoří sekundární elektrony, až 108 po zásahu jedním elektronem. Analogicky funguje fotonásobič, zde jde však o emisi sekundár. fotonů.

39. Analýza primární struktury proteinů (sekvencování) technikou MALDI MS 1. Peptide mass fingerprinting Vzorek proteinu je podroben enzymové nebo chemické degradaci, která je cílena na určitá místa v molekule („site-specific“). Vznikne tak směs peptidů, která je pak analyzována MS. Vhodnou technikou je MALDI TOF MS, neboť se jedná o poměrně složitou směs. Užívá se však i ESI TOF MS. Dnes již klasickou metodou je dřívější zdlouhavý postup, tedy separace peptidů HPLC a následná sekvenční analýza Edmanovou degradací. Sekvenční analýza proteinů s použitím MALDI TOF MS není založena na přesné identifikaci pořadí aminokyselin, ale na získání souboru dat pro vyhledávání v databázích.

40. vyříznout proužek rozřezat omýt (redukce) (alkylace) štěpení proteasou Příprava vzorku proč redukce a alkylace? rozvolnění S-S vazeb denaturace > lepší proteolýza ochrana oxidovaných reziduí Cys trypsin agresivní proteasa vysoká primární specificita, nízká sekundární prům. m/z fragmentu ~ 1.5 kDa štěpí: arginyl-X, lysyl-X; ale ne X=prolyl DTT, dithiothreitol KONTAMINACE! – keratiny (kůže, vlasy, srst, vlna) – detergenty (SDS, Triton atp.) IAA, jódoctová kys.

41. Princip ESI TOF MS a MALDI TOF MS

42. Hledáním v databázi je pak proteinový vzorek identifikován, nebo se zjistí, že jde o protein, který dosud v databázi není. Předpodkladem pro vyhledávání jsou naměřené přesné m/z hodnoty peptidových fragmentů, použítí specifické proteasy a přesná m/z intaktního proteinu. Pro štěpení se používají endoproteasy, tedy proteolytické enzymy, které štěpí uvnitř proteinové molekuly. Důraz se klade na specifitu použité proteasy, používají se proto vysoce specifické enzymy, jako je trypsin z hovězího či vepřového pankreatu (EC 3.4.21.4) nebo Lys C proteasa z Bacillus licheniformis (EC 3.4.21.50). Trypsin štěpí za bazickými zbytky Arg a Lys, proteasa Lys C za zbytkem Lysinu. Podobně Glu C proteasa ze Staphylococcus aureus V8 (EC 3.4.21.19) štěpí za Glu. Specificky lze štěpit chemicky použitím CNBr.

43. Bioinformatika pro MS organismy se sekvenovaným genomem PMF, statistická shoda predikovaných m/z tryptických peptidů (in silico digest) s experimentálními PC programy MASCOT (firma Matrixscience), SEQUEST, ProteinProspector organismy s nesekvenovaným genomem hledání na základě evoluční homologie proteinových sekvencí MS BLAST: MS drivenBest Local Alignment Search Tool MultiTag (S. Sunyaev et al.,Anal. Chem. 2003, in press)

44. Některé proteinové databáze na internetu

45. Peptide Mass Fingerprinting - PMF, MALDI TOF MS masses (m/z) 940.421 -ELSDIAR 1093.477 -QLLLTADDR 1341.556 -PHSHPALTPEQK 1469.633 -PHSHPALTPEQKK 1488.645 -GILAADESTGSIAKR 1646.650 -LQSIGTENTEWENRR 2122.975 -IGENHTPSALAIMENANVLAR 2241.903 -YTPSGQAGAAASESLFISNHAY

46. Identifikace Glukosa-6-fosfát dehydrogenasy

47. Identifikace hovězího sérového albuminu

48. Identifikace fosforylasy glykogenu

49. Někdy může navazovat použití specifických exoproteas a zjišťovat tak koncové aminokyseliny.

50. In-silico sequencing Počítačová predikce štěpných peptidů určitého proteinu. Výhodné použití pro usnadnění identifikace v analýze PMF v případě, že je vzorek znečištěn jinými proteiny. Rozumné použití pro max. 3 proteiny v jednom vzorku. Zadáním parametrů v PC programu např. Proteogest (použitý proces štěpení - CNBr, trypsin; výskyt posttranslačních modifikací etc.) se získá příslušný datový soubor