Biologie Moléculaire

Biologie Moléculaire Travailler avec l’ADN

Sujets • ADN Genomique vs. Vecteur • Purification d’ADNplasmidique • Enzyme de restriction • Essentielle de la cartographie de restriction

ADN • Genomique • Prokaryote vs. eukaryote • Circulaireoulinéaire • Un ou plus d’un chromosomes • Extra-genomique • Vecteurs • Plasmides

Vecteurs Vs Plasmides • Vecteur: • Véhiculed’ADNpermettant le clonage, maintien et amplification d’uneséquenced’ADN • Plasmides • Virus • Chromosomes • Tous les plasmidessont des vecteurs • Pas tous les vecteurssont des plasmides

Plasmides • Petites moléculesd’ADNcirculairesmaintenues et amplifiées chez des cellules eucaryotesouprocaryotes • Amplification chez les bactéries • Utilisé en tantquevecteur pour le clonageoul’expressiond’ADNd’intérêt

Caractéristiques des Vecteurs Plasmidiques • Sites de restrictions uniques pour le clonage • Origine de réplication (Ori) • Marqueur de sélection • Gènes de résistance aux antibiotiques

Isolation d’ADN • Buts • Isolation de l’ADN désiré • Chromosomique ou plasmidique? • Retirer les autres composantes • ADN chromosomique ou plasmidique? • Protéines • ARN • Produits chimiques • Sels, détergents, etc.

Isolation d’ADN (suite) • Lyse cellulaire • Paroi et membrane • Enzymatique • Chimique • Mécanique • Isolation de l’ADN désiré • Sédimentation différentielle • Chromatographie • Retirer les autres composantes • Enzymatique • Sédimentation différentielle • Chromatographie

Isolation d’ADN Plasmidique par Lyse Alcaline (E.coli)

Solutions Utilisées • Sol. I – Tampon de suspension • Tris HCl - Tampon, protège les acides nucléiques • EDTA - Chélates Mg++, empêche les nucléases de fonctionner • Sol. II – Solution de lyse • NaOH - ^pH lyse cellulaire, dénature ADN • SDS - dissous membranes, denture et lie protéines

Solutions Utilisées (suite) • Sol. III- Acétate de potassium • Renaturation de l’ADN • Précipite SDS • Précipite ADN génomique et protéines • Isopropanol / Éthanol • Précipite acides nucléiques (plasmide et ?) • Sels demeurent solubles • TE-RNase - Tris & EDTA encore; RNase??

Quantification de l’DNA • Déterminer la Conc. d’DNA • A260 de 1.0 = 50µg/mL ou 50ng/µL • Déterminer la quantitéd’DNA • 1mL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50µg DNA • 1µL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50ng DNA • Ne pas oublier de prendre en considération le FACTEUR DE DILUTION

Enzymes de Restriction • Clive les liens phosphodiester internes • Reconnaissent des séquences doubles brins spécifiques • Différentes endonucléases reconnaissent différentes séquences • Reconnaissent des séquences palindromes

Palindromes • La même séquence est lue dans la direction 5’» 3’ sur les deux brins 5’-G G A T C C-3’ 3’-C C T A G G-5’

5’-G G A T C C-3’ 3’-C C T A G G-5’ • Les mêmes liens phosphodiesters sont clivés sur les deux brins!

5’-G G A T C C-3’ 3’-C C T A G G-5’ Différentes Extrémités sont Générées Extrémités franches

5’-G G A T C C-3’ 3’-C C T A G G-5’ Différentes Extrémités sont Générées Extrémités 5’ protubérantes

5’-G G A T C C-3’ 3’-C C T A G G-5’ Différentes Extrémités sont Générées Extrémités 3’ protubérantes

Extrémités franches HO O OH P P P P O Compatibilité des Extrémités Compatible

Extrémités Protubérantes HO HO OH O P P P P Incompatible Compatibilité des Extrémités

Extrémités Protubérantes GATC-P GATC-P HO P-CTAG OH O O P-CTAG Compatibilité des Extrémités Appariement Compatible

Extrémités protubérantes GATC-P GATC-P HO P-TCCA OH OH HO P-TCCA Compatibilité des Extrémités Appariement Incompatible

Cartographie des Sites de Restrictions

D2 ND D1 L’ADN est-il digéré? Doit comparer à un témoin non digéré

D1 D2 ND La digestion est-elle complète? Doit comparer à un témoin non-digéré Partiel Complet

Digestion partielle • Toutes les molécules cibles ne sont pas coupées à toutes les sites possibles! • Génère différents produits intermédiaires

1 2 3 1 1 + 2 2 + 3 Digestion partielle Produit d’une digestion complète Produit d’une digestion partielle (intermédiaire) Produit d’une digestion partielle (intermédiaire)

Complète Vs Partielle • Une digestion complète donne une stoechiométrie de 1:1:1… • Le nombre de molécules de chacun des différents fragments est le même! • La stoechiométrie d’une digestion partielle est variable: • Ex. 1:3:2…

1 2 3 Ex. Combien de molécules de chacun des fragments seraient générées suite à une digestion complète? 3; donc une stœchiométrie de 3:3:3 =1:1:1 Combien de molécules de chacun des fragments seraient générées suite à une digestion partielle?

Évaluer la Stœchiométrie sur Gel d’Agarose • Principe • La quantité de bromure d’éthidium qui lie l’ADN est proportionnelle à la taille de l’ADN • La quantité de bromure d’éthidium qui lie l’ADN est proportionnelle à la quantité d’ADN • Dans le cas d’une digestion complète, la quantité de bromure d’éthidium qui lie l’ADN est seulement proportionnelle à la taille de l’ADN • Pourquoi?

D1 D2 Stœchiométrie pas respectée Stœchiométrie pas respectée Stœchiométrie respectée Stœchiométrie respectée Ex.

Exemples

1ièreétape: Déterminer le nombre de coupures • Est-cequel’ADN a étédigéré? • Non- Aucunecartographierequise • Oui • La digestion est-ellecomplète? • La digestion est-ellepartielle? • Quelsproduitssont des intermédiaires • Combien de foisl’ADN a-t-il coupé • Les coupuressontdans le vecteur • Aucunecartographierequise • Les coupuressontdansl’insertion • Cartographierequise

Combien de Sites de Restriction est-cequ’il y a? • ADN linéaire (ex. Chromosome humain) • Le nombre de coupuresestégal au nombre de fragments moins un • ADN circulaire (ex. Plasmide) • Le nombre de coupuresestégal au nombre de fragments

ND V B P E M B ? B E insert S Les coupuressont-ellesdansl’insertionou le vecteur? P Taille du vecteur 2.5kpb B coupe 2 fois dans le vecteur et 0 fois dans l’insertion E coupe 1 fois dans le vecteur et 1 fois dans l’insertion P coupe 1 fois dans le vecteur et 2 fois dans l’insertion

2eÉtape: Quellessont les positions des sites de restrictions? • Cartographie relative estfaite • Les sites de restriction sontcartographiés en relation en un point de référence • La position du point de référencedoitêtreconnue

ND V B P E M B ? B E insert S DoisDéterminer la Taille de l’Insertion P Taille du vecteur 2.5kpb • Déterminer la taille des fragments issus d’une digestion complète • Déterminer la taille totale du plasmide (Somme des tailles) • Déterminer la taille de l’insertion (Taille du plasmide - Taille du vecteur)

P E Ec Déterminer les Tailles Donc : Taille du plasmide 5Kpb Taille de l’insertion 5000pb – 2500pb = 2500pb

ou ou 0.9kbp 1.1kbp 0.9kbp 1.1kbp P P P P P P Impossible puisque le second site doit être dans l’insert! Impossible puisque le second site doit être dans l’insert! Cartographie du Site P Insertion (2.5kpb) Insertion (2.5kpb)

1.1kbp 1.1kbp P P P P 0.9kbp P Insert (2.5kpb) Cartographie du Site P (Suite) 0.9kbp P Insertion (2.5kpb) Ou

P Déterminer l’Orientation 1.0kbp E E Insertion (2.5kpb)

1.1kbp 1.1kbp P P P P 0.9kbp P Insert (2.5kpb) Déterminer l’Orientation 0.9kbp P Insertion (2.5kpb) 1.0kbp E E Or 1.0kbp E E

ND P E Ec P+E P+E Déterminer l’Orientation

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