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生化技术实验

生化技术实验. 生物实验中心 2009.10. 实验一 蛋白质含量测定 -- 双缩脲法. 一、 目的 学习掌握双缩脲法测定蛋白质含量 。 了解其它一些蛋白质定量方法。 (BCA 法、 folin- 酚试剂法，即 lowry 法，紫外分光光度法 ,280nm ）. 实验一 蛋白质含量测定 -- 双缩脲法. 二、原理： 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。 在 碱性 溶液中 双缩脲与铜离子 结合形成复杂的 紫红色复合物， 而蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与铜离子在在碱性环境中形成紫红色复合物，其最大光吸收在 540nm 。

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  1. 生化技术实验 生物实验中心 2009.10

  2. 实验一蛋白质含量测定--双缩脲法 • 一、目的 • 学习掌握双缩脲法测定蛋白质含量。 • 了解其它一些蛋白质定量方法。 • (BCA法、folin-酚试剂法，即lowry法，紫外分光光度法,280nm）

  3. 实验一蛋白质含量测定--双缩脲法 • 二、原理： • 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。 • 在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫红色复合物，而蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与铜离子在在碱性环境中形成紫红色复合物，其最大光吸收在540nm。 • 在一定浓度范围内，蛋白质浓度与双缩脲反应所呈颜色深浅成正比，可用比色法定量测定。

  4. 实验一蛋白质含量测定--双缩脲法 三、仪器与实验试剂 1、实验仪器 试管10ml（×7）/ 2人 不同刻度吸管若干支。

  5. 实验一蛋白质含量测定--双缩脲法 三、仪器与实验试剂 2、实验试剂： 2.1、双缩脲试剂：取1.5g硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0g酒石酸钾钠（NaKC4H406·4H2O）溶于500ml蒸馏水中，搅拌加入300ml的10% NaOH液（可另加1gKI以防止Cu离子自动还原成一价氧化亚铜沉淀），用水释至1000ml。此试剂可长期保存。若有黑色沉淀产生需重配。 （已配制好，可直接取用）

  6. 实验一蛋白质含量测定--双缩脲法 三、仪器与实验试剂 2、实验试剂： 2.2 标准蛋白溶液：10mg/ml的酪蛋白溶液可用0.9%NaCl溶液配制 2.3 待测样品液：用酪蛋白配制

  7. 实验一蛋白质含量测定--双缩脲法 四、实验操作方法 1．标准曲线的绘制 取干净试管6支，按0、1、2、3、4、5、6编号，按下表加入。各管加入试剂，充分混匀，即有紫红色出现，用540nm光测定各管A值，绘制C—A曲线。

  8. 实验一蛋白质含量测定--双缩脲法 四、实验操作方法 2．样液测定 取未知浓度的蛋白液3.0ml置试管内，加入双缩尿试剂2.0ml，混匀，测其540nm的值，对照标准曲线方程，求得未知液蛋白浓度。 (注意：计算浓度时，不要把2ml双缩脲试剂计算在内，只能按3ml体积计算,测定液放置不能擦后果30分钟，防止出现沉淀)

  9. 实验一蛋白质含量测定--双缩脲 • 实验报告： • 1、简写出实验目的、原理 • 2、作出标准曲线图并得出标准曲线和相关系数。 • 3、计算未知蛋白液的浓度。 • 4、写出实验注意事项与讨论 • （注意：一定要把原始数据填入原始数据栏）

  10. 实验二、植物多糖的提取、分离与鉴定

  11. 一. 实验目的 • 了解热水提取多糖的过程与注意事项。并了解目的物质提取过程中的主要影响因子及其相互关系。 • 掌握sevag试剂法除蛋白和乙醇沉降多糖的方法与注意事项。 • 并学会使用旋转蒸发仪分离浓缩目的物质。

  12. 二 .实验原理 • 用热水提取真菌植物子实体中的多糖,利用多糖类物质在热水中溶解度较高,将其提取出来。 • 利用sevag试剂将游离蛋白变性成为不溶性物质,经离心分离去除,可达到去除杂蛋白的目的 • 接着利用多糖在乙醇中溶解度降低的原理将多糖从溶液当中沉降出来。

  13. 三、 仪器 • 中低速离心机、循环真空泵、布式漏斗、高速干粉粉碎机、恒温水浴锅、旋转蒸发仪，可见分光光度计。250ml烧杯、试管、移液管若干、1000mL的磨口锥形瓶1个/组。

  14. 四、试剂 • 蒸馏水1000ml左右/组，平菇干燥粉末20克/组 • 0.1mg/mL的葡萄糖溶液15ml/组; 蒽酮试剂10ml/组，0.5mol/L NaOH10ml/组；5%苯酚体积15ml/组。

  15. 五、操作 • 1、平菇多糖的提取 • 取平菇干粉10克/每组，1000ml的的磨口锥形瓶中，按料液比15ml/克原料加入蒸馏水，轻轻摇匀。 • 将该装有原料液的锥形瓶放置于85℃的水浴锅中进行恒温萃取90min。萃取过程中，每隔15min左右轻轻摇晃锥形瓶。萃取完成后，将其放在离心管中，在4000r/min条件下离心15min，得到平菇多糖提取液。

  16. 五、操作 • 2、平菇多糖的分离纯化 • 在250ml分液漏斗中加入旋蒸仪中浓缩得到的25ml左右多糖提取液，然后按提取液：Sevag试剂[氯仿:正丁醇=2:1(v:v)的混合液]3:1的比例加入Sevag试剂。 • 混匀后于分液漏斗中振摇10min，用50ml离心管在3500r/min下离心然后静置到分层清晰,弃去下层有机相以及中间蛋白质与Sevag试剂生成的凝聚物, 得上清液。

  17. 五、操作 • 2、平菇多糖的分离纯化 • 将所得上清液，倒入250ml烧杯中，按多糖液体积：乙醇体积l:3的比例加入纯乙醇，在4℃冷藏条件下下沉降1h，待沉降完全后，将烧杯中的溶液放在离心管中，在4000r/min条件下离心15min，得到平菇多糖沉淀。

  18. 五 操作 • 3、平菇多糖的鉴定 • 离心得到的粗多糖充分溶解于50mL蒸馏水中，备用 • 3.1 多糖定性鉴定 • 3.1.1甲醇法:多糖样品配成lmg/ml水溶液，取lmL0.5mol/LNaOH，加入甲醇lml，出现白色混浊现象，则判断为有多糖。(以蒸馏水作为对照)。 • 3.1.2蒽酮法:多糖样品配成lmg/ml水溶液，取0.lml，加入lml0.5molNaOH，再加入蒽酮试剂几滴，呈蓝色的反应，则判断为有多糖。(以蒸馏水为对照)。

  19. 五 操作 • 3.2 定量测定 • 3.2.1葡萄糖标准曲线的制作及回归方程的确定 • 精密吸取标准葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于10mL以上的试管中,补加蒸馏水至2mL; • 另精密吸取2mL蒸馏水作空白对照,分别加入5%苯酚溶液1mL,混合均匀后快速加入浓硫酸5.0mL,即刻摇匀,室温静置20min,于分光光度计490nm处测定吸收度。以吸收度A1为纵坐标,葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线,可得回归方程:葡萄糖浓度在10～60μg·mL-1范围内,与吸光度呈良好的线性关系。

  20. 五 操作 表1 吸光度-葡萄糖浓度对照数据

  21. 五 操作 • 3.2.2 样品浓度测定 • 吸1 mL多糖液分别用蒸馏水稀释到100倍后，再取1mL稀释到100倍，待用。 • 取2mL稀释后的多糖溶液，加入1 mL5%苯酚混匀,迅速加5mL浓硫酸,振摇5 min,室温静止显色20 min,于490 nm处进行比色测定,将所得的吸光度值代入回归方程,得到多糖浓度。

  22. 六 计算 • 多糖得率=葡萄糖浓度×稀释倍数×原液体积／子实体干重×100％ • 其中稀释到10000倍是：葡萄糖浓度(mg/ml)×（4×10000) ×50／(1000× 20)mg × 100 ％

  23. 七 注意事项 • 1、实验当中要用到浓硫酸，大家一定要注意实验过程中的安全，要认真细致，不要打闹，以免发生事故！ • 2、实验过程中有多次将硫酸加入到别的试剂中的过程，加入试剂时是最后加硫酸的，同时摇匀时要注意动作幅度要小，千万不要将药品洒出来。

  24. 七 注意事项 • 3、进行分光光度测定时，前面试剂混合均匀后，要快速加入浓硫酸,即刻轻轻摇匀。 • 4、实验过程中有多次离心，一定要注意要将离心管配平，两管之间不能相差超过0.1克。 • 5、测吸光度时，比色杯中试液的量一定不能超过比色杯的2/3，否则可能导致待测液洒出来，污染分光光度计。

  25. 七 注意事项 • 6、测完吸光度值后，将所有溶液倒入分光光度计室的桶内，然后由指定人员提到楼下指定地点倒掉。千万不要轻易倒入下水道。 • 7、实验完毕后，各组将自己所用的所有仪器设备清洗干净并整齐排放在桌子上。 • 另外班干部留下来作统一整理。

  26. 七 注意事项 • 8、 在确定标准曲线作图时，用吸光度值做纵坐标，以浓度值为横坐标（即以，0.02/8、0.04/8、0.06/8……），单位是mg/mL.。 • 不要去算此时稀释的浓度，因为后面的含量计算时，已经乘以8倍了。

  27. 七 注意事项 • 9、实验过程中，若发现打闹嬉笑可能导致危险事故的同学，为了他人和自身安全着想，则终止其实验，劝其离开实验室。 • 10 实验过程中，要注意填写使用记录。

  28. 实验三 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 • 一、目的要求 • 1.学习电泳原理和技术 • 2.学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术

  29. 二、原理 • 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(N，N，N，N—tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。

  30. 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。 • 目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。 • 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由过硫酸铵（AP）催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

  31. （1）样品浓缩效应 • (a)凝胶孔径不连续性： • (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性； • 在pH6.7的凝胶缓冲体系中 • 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) • 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 • mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度) • 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质； • （c)电位梯度的不连续性： • (2)分子筛效应：大分子跑得慢，小分子跑得快 • (3)电荷效应 • SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） ：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。

  32. 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： • (1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； • (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； • (3)对pH和温度变化较稳定； • (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； • (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g • (6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； • (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。

  33. 三、试剂与器材 • 试剂：10%SDS、 凝胶贮液（30％ACr-0.8%Bis)、分离胶缓冲液（3.0 mol/L pH8.9Tris－HCl 缓冲液）、 浓缩胶缓冲液（ 0.5 mol/L pH6.7Tris－HCl 缓冲液）、10%过硫酸铵、 10%TEMED、 pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、 1%琼脂糖溶液、0.05％考马斯亮兰R250 、7%醋酸 • 器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪 、脱色摇床

  34. 四、 操作方法 • 1.安装夹心式垂直板电泳槽 • 先把垂直平板电泳槽和两块玻璃板洗净，晾干。将封胶带放在两块玻璃板之间，两块玻璃板之间应有空隙，两边用夹子夹紧。将1%的琼脂糖融化，冷至50度左右，用吸管吸取热的1%的琼脂糖沿玻璃板的三侧加入，封住缝隙，冷后凝胶凝固，备用

  35. 2、试剂制备：都已配好 • 3. 制备凝胶板 • （1）分离胶：将混合后的分离胶溶液，立即用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1 cm（可以先先量好，确定好加胶的位置）。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约3–4 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。 约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。待分离胶聚合完全后，除去覆盖的重蒸水，尽可能去干净。 • （2）浓缩胶：将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)，距短玻璃上缘0.5 cm处，轻轻加入样品槽模板，避免混入气泡.垂直静置约30 min左右，上胶即可聚合，再放置10-20 min，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5 cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。

  36. 4. 加样 • 用微量进样器或移液枪吸取样液（含蔗糖及溴酚兰）10微升样液小心加入到样品孔中。

  37. 5 ．电泳 • （1）．将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，接通冷却水，打开电泳仪开关。 • 以浓缩胶中100V，分离胶中180V电压进行电泳，至距底线1cm时关闭电源 • （2）.在胶块与玻板间小心地用注射针注入蒸馏水，现从短玻板上剥离，再用同样的操作从长玻板上剥离。将其置于培养皿中，用蒸馏水冲去残留缓冲液，加入染色液将凝胶完全浸泡其中，放入微波炉内，高火档照射20秒，停留1min再照射10秒， 然后取出，将皿置于冷水中冷却后，重复操作。反复几次至凝胶上色后倒出染色液，用蒸馏水冲去残留染色液，加入脱色液，高火档照射20秒，倒出脱色液，再加入新鲜脱色液照射20秒，每做一次要冷却一次。重复5－6次，直至背景清晰透明，将培养皿中所有液体倾倒干净，将培养皿连同胶块放在凝胶分析仪上成像分析。

  38. 6. 结果处理 • 量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR: • 相对迁移率mR = 蛋白质样品距加样点中心距离/溴酚兰区中心离加样点中心距离

  39. 五、注意事项 • （1）用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。 • （2）样品中应含一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防止样品因对流而被稀释。 • （3）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。 • （4） 凝胶储备液有毒，要戴手套操作。 • （5） 在灌胶前一定要注意对玻璃板进行封胶，以免漏胶，可在培养皿中进行。 • （6）注射器针头是用来剥胶和剔除气泡的，不能用来灌胶，否则会导致注射针堵塞。

  40. 实验报告： • 1、简写出实验目的、原理 • 2、铅笔做出电泳模拟图，并标上自己的样点的Rf • 3、写出实验注意事项与讨论 • 4、为什么要在样品中加少许溴酚兰和一定浓度的蔗糖溶液？蔗糖及溴酚兰的作用分别是什么？ • （注意：一定要把原始数据填入原始数据栏）

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