2. laboratorijas darbs. Spektrofotometrija.

1. Studiju kurssBioloģija (biologiem) BloksŠūnas bioloģija, bioķīmija, ģenētika 2. laboratorijas darbs. Spektrofotometrija. Māris Lazdiņšlazda@latnet.lv LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

2. Kas ir gaisma? - Kvantu plūsma. - Noteikta diapazona elektromagnetiskais starojums. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

3.   C = 300 000 km/s Kas ir gaisma? Elektromagnetiskā starojuma viļņu garums -  (nm).  - attālums, kuru starojums veicis vienas svārstības laikā. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

4. Kas ir gaisma? Elektromagnetisko starojumu pēc tā - īpašībām un - mijiedarbības ar dzīvās un nedzīvās dabas objektiem iedala vairākos diapazonos:  diapazons 10 km – 1 mm - radiodiapazons 1 mm – 800 nm - infrasarkanais starojums 800 nm – 350 nm - redzamā gaisma 350 nm – 1 nm - ultravioletais starojums 1 nm – 10 pm - rentgena starojums 10 pm – 100 fm -  starojums LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

5. Redzamā gaisma  krāsa 760 nm – tumši sarkans 660 nm – sarkans 590 nm – oranžs 560 nm – dzeltens 500 nm – zaļš 480 nm – gaiši zils 450 nm – zils 380 nm – violets LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

6. Kā mēra gaismas un vielas mijiedarbību? I1 I2 Transmisija – (T = I2/I1) Transmisijas % – T% = (I2/I1)  100 Transmisijas% parāda cik % starojuma izkļuvuši cauri videi. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

7. Kā mēra gaismas un vielas mijiedarbību? Turpinot pētījumus noskaidrojās, ka T ir atkarīga no: - starojuma ceļa garuma; - vielas koncentrācijas šķīdumā; - izmantotā starojuma ; - konkrētai vielai raksturīga starojuma absorbcijas koeficienta pie noteikta starojuma . LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

8. Kā mēra gaismas un vielas mijiedarbību? Sakarību apraksta Bera likums: T=10-kcl k – konkrētai vielai raksturīgs starojuma absorbcijas koeficients pie noteikta starojuma ; c – vielas koncentrācija šķīdumā; l – starojuma ceļš cauri šķīdumam. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

9. Kā mēra gaismas un vielas mijiedarbību? Praksē bieži izmanto Lamberta – Bera likumu un mērvienības: Absorbcija (A) Ekstinkcija (E) Optiskais blīvums (D; OD) A = - lg(T) = kcl LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

10. Kādas iekārtas izmanto spektrofotometrijā? Spektrofotometrs (SF) Kivete ar paraugu Starojuma intensitātes mērītājs Starojuma avots Kondensors Dispersijas sistēma Optiskā sprauga LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

11. Kādas iekārtas izmanto spektrofotometrijā? Fotoelektrokolorimetrs (FEK) Kondensors Optiskie filtri Starojuma avots Kivete ar paraugu Starojuma intensitātes mērītājs LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

12. OD (o.v.)  (nm) 400450500550600650700 Absorbcijas spektrs Grafiks - absorbcijas (optiskā blīvuma) atkarība no viļņu garuma LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

13. Cilvēka acs jūtība % 100 80 60 40 20 0  (nm) 400450500550600650700 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

14. Absorbcijas spektrs Grafiks - absorbcijas (optiskā blīvuma) atkarība no viļņu garuma OD (o.v.)  (nm) 400450500550600650700 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

15. Absorbcijas spektrs Grafiks - absorbcijas (optiskā blīvuma) atkarība no viļņu garuma OD  400450500550600650700 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

16. Absorbcijas spektrs Grafiks - absorbcijas (optiskā blīvuma) atkarība no viļņu garuma OD  400450500550600650700 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

17. Absorbcijas spektrs  400450500550600650700 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

18. Pie darba ? LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

19. Absorbcijas spektra noteikšana 1. tabula  (nm) OD1 (o.v.) OD2 (o.v.)  (nm) OD1 (o.v.) OD2 (o.v.) 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

20. Absorbcijas spektra noteikšana OD  400450500550600650700 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

21. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

22. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

23. Ūdens un sausnas satura noteikšana 2.1. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

24. Proteīnu kvantitatīva noteikšana 2.2. Pamatā - krāsu reakcija Bradfordas + proteīni => zils krāsojums reaģents (mērījumiem izdevīgs (brūns)  = 590 nm - oranža gaisma) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

25. Proteīnu kvantitatīva noteikšana http://en.wikipedia.org/wiki/Bradford_protein_assay http://www.histosoft.com/services/background/ba/baback.html#ref LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

26. Proteīnu kvantitatīva noteikšana 2.3. - reakcijas “kalibrēšana” Reakciju veic ar zināmas koncentrācijas proteīnu (BSA) šķīdumiem, - lai iegūtu OD sakarību ar proteīnu koncentrāciju. 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,8 mg/ml. Ar katras koncentrācijas šķīdumu veic 3 atkārtotas reakcijas/mērījumus. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

27. Proteīnu kvantitatīva noteikšana 2.4. Reakcijas un mērījumu gaita: 1. Kivetē iepilda 2 ml Bradfordas reaktīva (2 reizes pa 1000 l). Kivetes ņemt aiz rievotajām/matētajām malām! Sekojiet, lai kivetes rievotās/matētās malas neievietotu gaismas ceļā! Pārbaudiet vai FEK uzstādīts oraņžais filtrs. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

28.  Ieslēgt / izslēgt Proteīnu kvantitatīva noteikšana 2.4. Reakcijas un mērījumu gaita: 2. Nospiežot pogu „R“, aparātu iestāda uz D = 0 (T% = 100). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

29. Proteīnu kvantitatīva noteikšana 2.4. Reakcijas un mērījumu gaita: 3. Izņem kiveti un pievieno 20 l proteīnu šķīdumu. 4. Ar 1000 µl automātiskās pipetes palīdzību (iesūcot un izpūšot) samaisiet šķīdumus un ielieciet kiveti FEK. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

30. T Proteīnu kvantitatīva noteikšana 2.4. Reakcijas un mērījumu gaita: 5. Pēc 1 minūtes izdara mērījumu, nospiežot taustiņu „T“. 6. Rezultātu pierakstiet 3. tabulā. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

31. Proteīnu kvantitatīva noteikšana • 2.4. Reakcijas un mērījumu gaita: • Katrai reakcijai jālieto jauna kivete! • Katrai kivetei ar reaģentu individuāli jāiestāda OD = 0,00 • (nospiežot kontroles (references) taustiņu “R”). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

32. Proteīnu kvantitatīva noteikšana 2.3. - reakcijas “kalibrēšana” 3. tabulā jāieraksta reakcijā izmantoto proteīnu (BSA) masa. 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,8 mg/ml. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

33. Proteīnu kvantitatīva noteikšana 2.5. Reakcijas “kalibrēšanas” grafiks Pēc iegūtajiem rezultātiem uz milimetru papīra konstruē graduācijas grafiku. - uz X ass atliek proteīnu masu (g), kura ar 20 l BSA šķīduma tika ienesta reakcijā. - uz Y ass atliek vidējo nomērīto optisko blīvumu (o.v.). Vienības uz asīm izvēlieties tā, lai racionāli tiktu izmantots viss milimetru papīra laukums! LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

34. Proteīnu kvantitatīva noteikšana 2.5. Reakcijas “kalibrēšanas” grafiks . D (o.v.) . . . Grafikam jāsanāk lineāram! g BSA / 20 l šķīduma LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

35. Proteīnu kvantitatīva noteikšana 2.6. Proteīnu kvantitēšanas reakcijas analizējamo pārtikas produktu lizātiem. Veic reakcijas un mērījumus ar pārtikas produkta lizātu. (2 atkārtojumus) Rezultātus ieraksta 4. tabulā un aprēķina vidējo vērtību. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

36. . D (o.v.) . . . g BSA / 20 l šķīduma Proteīnu kvantitatīva noteikšana 2.6. Proteīnu kvantitēšanas reakcijas analizējamo pārtikas produktu lizātiem. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

37. Proteīnu kvantitatīva noteikšana 3.2. Proteīnu satura aprēķini produktos. No grafika nolasītos rezultātus ieraksta arī 5. tabulā. Tabulā apkopo arī grupas biedru rezultātus (proteīnu g / 20 l šķīduma, nevis OD !!! ). Veic aprēķinus un izsaka: - proteīnu daudzumu (g) 100 g svaiga produkta; - % no sausnas masas. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

38. Veiksmi darbā LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

39. Uz nākošo nodarbību (mājas darbs) ! Rezultātu apstrāde un secinājumi: 3.1. 3.2. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML