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Pesquisador PRODOC: Luiz Carlos Alcântara Responsável Institucional: Bernardo Galvão-Castro

Correlações do Polimorfismo Genético do Vírus Linfotrópico de Células-T Humanas do Tipo 1 (HTLV-1) com o Polimorfismo dos genes do Hospedeiro Envolvidos no Desenvolvimento de TSP/HAM em Salvador. Pesquisador PRODOC: Luiz Carlos Alcântara Responsável Institucional: Bernardo Galvão-Castro

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Pesquisador PRODOC: Luiz Carlos Alcântara Responsável Institucional: Bernardo Galvão-Castro

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Presentation Transcript

  1. Correlações do Polimorfismo Genético do Vírus Linfotrópico de Células-T Humanas do Tipo 1 (HTLV-1) com o Polimorfismo dos genes do Hospedeiro Envolvidos no Desenvolvimento de TSP/HAM em Salvador. Pesquisador PRODOC: Luiz Carlos Alcântara Responsável Institucional: Bernardo Galvão-Castro Área: Medicina da Saúde – Sub-área: Epidemiologia molecular dos microorganismos

  2. Objetivos • Caracterização molecular do genoma proviral (U3-LTR) dos indivíduos infectados – Análise dos polimorfismos destas regiões relacionando os mesmos com o desenvolvimento de TSP/HAM; • Caracterização molecular de genes do hospedeiro envolvidos no mecanismo de transativação por Tax (promotores de IL2, IL2-R, IL6) em indivíduos infectados assintomáticos e com TSP/HAM; • Determinar a carga proviral nos indivíduos infectados, assintomáticos e com TSP/HAM, correlacionando estes resultados com as alterações genotípicas do hospedeiro.

  3. QUAL A IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DO POLIMORFISMO NA REGIÃO LTR VIRAL?

  4. Ainda não se sabe porque a infecção pelo HTLV-I na maioria dos indivíduos resulta em uma infecção assintomática, enquanto poucos desenvolvem doença. • Há poucas investigações que têm determinado correlações entre as manifestações clínicas e as alterações polimórficas nos genes provirais envolvidos na patogenicidade de Tax. • Correlações entre o polimorfimo viral e o desenvolvimento de TSP/HAM no Japão. 5’ 3’ LTR GAG POL ENV X LTR 3’ 5’

  5. ESTRUTURA DO LTR DO HTLV-I U3 R U5 TATA box ATT 21-pb enhancer Sinal de poliadenilação

  6. 5’ 3’ LTR GAG POL ENV X LTR 5’ 3’ Transcrição TAX CREB/ATF 5’ 3’ TAX/CREB LTR TRE 1 TRE 2 TRE 3 3’ U3 R U5 5’ 9032 pb TRE - Elemento de resposta a TAX

  7. Manuscrito em fase final de preparação ( Trabalho premiado da Jornada Científica do IOC/FIOCRUZ - 2005 ) POPULAÇÃO ESTUDADA ( n=88 ) CHTLV n= 6 TSP/HAM total= 36 FNN n= 30 CHTLV n= 34 ASSINTOMÁTICOS POPULAÇÃO GERAL n=3 total= 52 FNN n=12 ACRE n= 3

  8. CHTLV n= 18 Menor 45 anos BAHIA AZUL n=3 total n=32 ASSINTOMÁTICOS FNN n= 9 ACRE n= 2 Maior 45 anos CHTLV n=16 FNN n=3 total=20 ACRE n=1

  9. RESULTADOS Análise da Freqüência de Mutações no gene LTR3’ (355 pb) *A significance level p<0.05value was calculated by x2 test Table 1: Analysis of the frequency (%) of mutations in gene LTR3’ (355pb) between asymptomatic and symptomatic group. Comparing with the LTR ATK1 Japaneseprototype: We detected a -632C>T mutation (19,2%; p=0.024).

  10. RESULTADOS PRELIMINARES Análise da Freqüência de Mutações no gene LTR3’ (355 – 55 pb) * A significance level p <0.05 value was calculated by x2 test Table 2: Analysis of the frequency (%) of mutations in gene LTR3’(355pb) asym patients by age (up and down 45), comparing with the LTR ATK1 Japaneseprototype: the -631-632C insertion was detected only in younger asym patients (25%, p=0.017).

  11. A mutação -632C>T está presente no grupo assintomático (19,2%; p=0.024). • Quando dividimos os pacientes assintomáticos pela idade (menor e maior que 45), uma inserção na posição -631C foi detectada somente no grupo com maior idade (25%, p=0.017). Estudos anteriores não encontraram correlações entre variações gênicas específicas e as diversas manifestações clínicas como ATLL e TSP/HAM (Osame et al., 2000). • Em resumo, as mutações detectadas na região U3-LTR dos isolados do HTLV-1 poderiam estar relacionadas com a eficiência no mecanismo de transcrição viral e desenvolvimento da TSP/HAM. • Na análise filogenética, todos os isolados da América Latina (do subtipo Cosmopolita, subgrupo Transcontinental) apresentaram as mutações nas posições –632 e –452, enquanto as mutações –595, -471 e –631 foram encontradas apenas fora deste grupamento.

  12. QUAL A IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DO POLIMORFISMO NOS PROMOTORES DAS CITOCINAS?

  13. Ainda não se sabe porque a infecção pelo HTLV-I na maioria dos indivíduos resulta em uma infecção assintomática, enquanto poucos desenvolvem doença. • Há poucas investigações que têm determinado correlações entre as manifestações clínicas e as alterações polimórficas nos genes das várias proteínas do hospedeiro envolvidas na patogenicidade de Tax. • Estudo das propriedades moleculares e biológicas dessas proteínas nos indivíduos infectados fornecerá informações importantes sobre a patogenicidade do vírus; • Correlações entre o polimorfimo nos genes do hospedeiro e o desenvolvimento de TSP/HAM no Japão.

  14.  IL-6 IL-6 Células T citotóxicas Células B Potencializa a diferenciação na presença de IL-2 e IFN- Células T Células tronco hematopoiéticas Diferenciação e secreção de anticorpos Co-estimulante Atividade estimuladora de colônia Produção de IL-2 e de receptor de IL-2 http://www.nature.com/emboj/journal/v16/n5/thumbs/7590092f1.jpg http://adams.mgh.harvard.edu/Reeves/Research%20Images/Cytokinealign.jpg6

  15. Ativação de macrófagos e células T IL-1 + Crescimento e diferenciação de células B TNF- IL-6 + Resposta de fase aguda fator de crescimento derivado de plaquetas + + + - Hematopoiese endotoxinas infecção viral glicocorticóides esteróides • Normalmente IL-6 é expressa em níveis muito baixos. • Infeçção, estresse, trauma:  níveis • Menopausa e andropausa:  níveis Ershler WB & Keller ET, 2000

  16. Vários estudos têm mostrado correlação: polimorfismos em genes de citocinas, entre elas IL-6, e susceptibilidade/ resistência a algumas doenças  lupus, artrite reumatóide, diabetes, artrite juvenil • Polimorfismos de um único nucleotídeo: SNP  podem afetar a transcrição e a produção de citocinas fenótipos alto, intermediário e baixo produtor. Fishman et al, 1998

  17. A freqüência dos polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP) em genes de citocina e dos haplótipos podem diferir em populações com diferentes “backgrounds” (Cox et al. 2001; Meenagh et al. 2002; Darrin et al, 2001; Padyukov et al, 2001; Meenagh et al, 2002). •  ORIGEM GENÉTICA  Susceptibilidade a várias doença  ETNIA X POLIMORFISMO X SUSCEPTIBILIDADE/RESISTÊNCIA A DOENÇAS

  18. Representação esquemática da região 5’ do gene de IL-6, identificando os dois polimorfismos estudados e sítios de ligação para fatores de transcrição NFIL6 -158 -145 G A MRE NF-B TATA -174 -145 -73 -26 +1 -634 -597 -572 -174 G C G C G C Região de -180 a -123 é CRUCIAL para a transcrição de IL-6 induzida por vírus, segundos mensageiros e citocinas como IL-1 e TNF- Adaptado de Terry et al, 2000

  19. A freqüência de –174G/C IL-6 é altamente heterogêneo entre diferentes populações (Fishman et al. 1998; Cox et al. 2001; Hoffman et al. 2002), mas a variante –634G/C IL-6 foi estudada apenas em amostras asiáticas (Nishimura et al. 2002; Kitamura et al. 2002; Yamada et al. 2003). http://www.icviacilea.it/pagine/giornalino/giornale

  20. SNP –174 (GC): artrite reumatóide juvenil (Fishman et al, 1998), mal de Alzheimer (Licastra et al, 2003), hiperandrogenismo (Villuendas et al, 2002), susceptibilidade à diabetes tipo I (Jahromi et al, 2000), desenvolvimento de doenças cardiovasculares (Jenny et al, 2002). SNP -634 (GC): progressão da nefropatia diabética (Kitamura et al, 2002), diminuição da densidade mineral óssea (Ota et al, 2001).

  21. Polimorfismos nos promotores de IL-6 X Pacientes infectados com HTLV-I • População do Japão • diferença na distribuição do polimorfismo no promotor de IL-6 na posição –634 entre indivíduos HTLV-I positivos, assintomáticos e com HAM/TSP (Nishimura e cols, 2002).

  22. Pergunta: Existe associação desses Polimorfismos com a manifestação de TSP/HAM em indivíduos infectados com HTLV-1 de Salvador, Bahia, Brazil? ? G A GG GC CC T

  23. Resultado 1: 3 populacões brasileiras 293 amostras coletadas entre 1997 e 2001: 100 da população geral de Salvador (Dourado et al. 2003); 94 doadores de sangue de descendentes de Alemães de Joinville (Grimaldi et al. 2002); 99 da tribo Tiriyo, fronteira Brasil/Suriname (Shindo et al. 2002) http://www.firststudy.ch/schools/images_gross/Baiana.jpg ETHNIC DIFFERENCES IN THE DISTRIBUTION OF INTERLEUKIN-6 POLYMORPHISMS AMONG THREE BRAZILIAN ETHNIC GROUPS. Gadelha, S.R. 1; Alcântara, L.C.J. 1,2; Costa, G.C.S. 1; Rios, D.L. 1; Galvão-Castro, B. 1,2 1 Laboratório Avançado de Saúde Pública/Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz/ Fundação Oswaldo Cruz, Salvador, Ba; 2 Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública/ Fundação Bahiana para o Desenvolvimento das Ciências. Key words: interleukin-6, polymorphisms, Brazilian populations http://www.nippobrasil.com.br/3.turismo.br/ http://www.giemmegi.org/images/indios-1.jpg

  24. Tabela 1.1 Percentagem genotípica e freqüência alélica de polimorfismos no promotor do gene de IL-6 IL-6 nas posições –634G/C e –174G/C em três populações Brasileiras. *2: 147.648, df: 2; p<0.001 (freqüência alélica) 2: 76.100, df: 2; p<0.001 (freqüência alélica).

  25. Salvador (n*=200) % Tiriyó (n*=198) % Joinville (n*=188) % -634G/-174G 66.5 42.8 59.1 -634G/-174C 16.5 1.6 37.2 -634C/-174G 17.0 54.8 3.7 -634C/-174C - 0.8 - Tabela 1.2. Freqüência dos haplótipos (combinação -634G/C e –174G/C) no promotor de IL-6 em três diferentes populações do Brasil *n= número de cromossomos Salvador X Tiriyó: teste exato de Fisher: p<0,0001 Salvador X Joinvile: teste exato de Fisher: p<0,0001 Tiriyó X Joinvile: teste exato de Fisher: p<0,0001

  26. Africanos/ Afro-descendentes % Asiaticos/ Ameríndios % Europeus/ Europeus-descendentes % IL-6-174 G 89.7 - 90.7*,# (83.5) 95.5 – 100#,**,##,& (97.5) 61.7# (63.3) C 9.3 - 10.3*,# (16.5) 0.2 - 4.5#,**,##,& (2.5) 38.3# (36.7) Tabela 1.3. Freqüências alélicas do polimorfismo –174 IL-6G>C nos principais grupos étnicos • Cox et al, 2001; # Hoffman et al, 2002; ** Hayakawa et al, 2002; ## Zhai et al, 200; & Fishman et al, 1998

  27. As frequências alélicas dos polimorfismos -634G/C p<0.001) e -174G/C (p<0.001) diferiram nas três populações. • As frequências dos haplótipos variaram significativamente (p<0.0001) (Tabela 2). • A maior frequência do alelo C na posição –174 em descendentes alemães de Joinville é consistente com aqueles demosntrados previamente em populações de Europeus (Tabela 3). Resultados e Discussão Polimorfismos X Grupos étnicos

  28. A frequência do alelo C na posição –174 em amostrasde Salvador, embora um pouco maior que aquelas previamente observadas em Africanos e Afro-Americanos, está próximo daqueles descritos (Table 3). Este achado é consistente com dados históricos que mostram a importância da contribuição africana e européia em Salvador (Alcantara et al., JAIDS 2003; Alcantara et al., AIDS 2006). • A mais baixa frequência do alelo C na posição –174 foi encontrada na tribo Tiriyo. Esta frequência está na faixa observada para populações de origem asiática (Tabela 3). Estes dados são consistentes com a teoria da origem asiática dos Ameríndios, confirmando estudos anteriores em outros sistemas polimórficos (Ribeiro et al. 2003; Tokunaga et al. 2001).

  29.  Poucos estudos têm investigado o polimorfismo –634G  C no promotor do gene de IL-6, e todos foram realizados em populações asiáticas. • Este é o primeiro trabalho investigando este polimorfismo nestes grupos étnicos. • Primeiro estudo verificando freqüência dos haplótipos (-634 GC e -174GC).

  30. Resultados 2 Polimorfismos nos promotores dos genes da interleucina-6 em indivíduos infectados de SALVADOR. Existe associação com o desenvolvimento de doença neurológica? Manuscrito em fase final de preparação

  31.  Tipo de estudo: Corte-transversal • População alvo: Pacientes portadores de HTLV-I de demanda espontânea ou referenciada para o Centro de HTLV da Fundação Bahiana para o Desenvolvimento das Ciências (FBDC), confirmadamente positivos. • Número de amostras analisadas: • Indivíduos assintomáticos: 84 • Pacientes com HAM/TSP: 26 • Sintomáticos: 23 • Soronegativos: 100

  32. Tabela 2.0. Frequência alélica do polimorfismos nas posições –634 e –174 do promotor de IL-6 em indivíduos infectados pelo HTLV-I atendidos no CHTLV/FIOCRUZ e indivíduos soronegativos provenientes de Salvador/ Bahia. p>0.05

  33. Tabela 2.1. Frequência alélica do polimorfismos nas posições –634 e –174 do promotor de IL-6 em indivíduos infectados pelo HTLV-I assintomáticos, oligosintomáticos, com HAM/TSP, e em indivíduos soronegativos -174GC -  do alelo G e  do alelo C nos indivíduos com HAM/TSP quando comparados com indivíduos oligosintomáticos (p=0.03). HAM/TSP X assintomáticos: p=0.14 -634GC -  Alelo C em HAM/TSP em relação aos assintomáticos (p=0.03) e oligosintomáticos (0.01). Assint X Oligos p=0.5

  34. Tabela 2.2. Freqüência dos haplótipos (combinação -634G/C e –174G/C) no promotor de IL-6 nos indivíduos infectados pelo HTLV-1. *genótipos relacionados a uma maior susceptibilidade a HAM/TSP

  35. -597 G/A Monomórfico: todas as amostras foram GG -572 G/C A três genótipos G/A (3.8%). Todos os demais G/G (96.2%) Promotor de IL-2: 20 amostras sequenciadas – fragmento de 310pb – região onde NF-B se liga • 10 pacientes sintomáticos e 10 assintomáticos para o HTLV– nenhuma diferença/ nenhum polimorfismo detectado

  36. http://www.monografias.com Carga proviral http://www.tthhivclinic.com/

  37.  14 pacientes HAM/TSP  53 assintomáticos Carga proviral (número de cópias/106cels) HAM/TSP X Assintomáticos número de cópias/106cels Mann-Whithney: p=0.0001

  38. Carga proviral X Genótipo na posição -174 do promotor de IL-6 Carga proviral X Genótipo na posição -634 do promotor de IL-6 número de cópias/106cels número de cópias/106cels Mann-Whithney: p=0.97 Mann-Whithney: p=0.66 -634 G/C Mediana GG: 28665 cópias/106 céls GC: 20624 cópias/106 céls -174 G/C Mediana GG: 22189 cópias/106 céls GC: 20945 cópias/106 céls

  39. Agradecimentos • Bernardo Galvão Castro Filho (Coordenador) • Sandra Rocha Gadelha (Doutorado) • Sérgio de Araújo Pereira (Doutorado) • Giselle Calazans de Souza Costa (Iniciação científica e mestrado) • Cinara Carvalho(Apoio técnico); • Simone Kashima (Colaborador) • Anne-Mieke Vandamme (Colaborador) • Ceuci Nunes (Clínica) • Rodrigo Gaspar (Administração do projeto) • Equipe do LASP/CPqGM e Centro de HTLV (FBDC/EBMSP) • FAPESB

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