Szintetikus Kémiai Biológia

1. Szintetikus Kémiai Biológia Riboszómális peptidszintézis Kvvn9756/1 A modern kémia problémái 2011. november 9.

2. Centrális Dogma • A Centrális Dogma a genetikai információ áramlását írja le • A sejtmagban a DNS-ből egyszálú komplementer RNS képződik (transzkripció) • Az RNS a citoplazmába vándorol, ahol arról a riboszóma fehérjét készít (transzláció) • A fehérje ezután módosulhat (poszttranszlációs módosulás) • A DNS információt tárol • Az RNS és fehérjék az információt továbbítják, az információátadást katalizálják Replikáció DNS polimeráz Transzkripció RNS polimeráz Transzláció tRNS, riboszóma

3. DNS és RNS képző nukleotidok

4. DNS nukleotid mutációk deamináció deamináció deamináció deamináció HF*: Miért előnyösebb a természet számára uracil helyett timint használni a DNS-ben?

5. DNS és RNS képző nukleotidok (hipoxantin+ ribóz)

6. Watson-Crick bázispárok guanin citozin timin adenin

7. Watson-Crick bázispárok Nem Watson-Crick bázispárok inozin adenin inozin citozin guanin citozin inozin uracil guanin uracil timin adenin

8. Genetikai kód Három nukleotid kódol egy aminosavat A kód nem átfedő A kódban nincsenek „írásjelek” A genetikai kód degenerált (szinonímák)

9. Wobble hipotézis • az mRNS első két bázisa erős WC párt alkot a tRNS megfelelő antikodonjával • ha az antikodon első bázisa (ami a kodon harmadik bázisával párosodik) A vagy C, akkor a bázispárosodás specifikus, és csak egy kodont ismer fel a tRNS • ha az antikodon első bázisa G vagy U, akkor kétféle kodont ismer fel a tRNS (G::C/U; U::A/G) • ha az antikodon első bázisa I (inozin), akkor háromféle kodont ismer fel a tRNS (I::A/U/C) • 32 tRNS szükséges a 61 kodon leolvasásához (31 az aminosavakhoz és egy az iniciációhoz) • A ribszóma ellenőrzi az mRNS kodon hármasának első két bázisának illeszkedését Következmény: Megfelelő specificitsás és sebesség a transzláció során.

10. 3’ 5’ aminosav kar D kar TyC kar antikodon kar anti kodon Transzfer RNS (tRNS) • egyszálú RNS, 73-93 bázis • számos módosított bázis (7-15) • inozin • metilált származékok • Pszeudouridin (y) • ribotimidin (T) stb. • 5’ első bázis: guanin (pG) • 3’ utolsó bázisok: CCA • 3’ végén az adenin 3’ OH csoportja hordozza az aminosavat • aminoacil tRNS • jellegzetes két- és háromdimenziós szerkezet • A bázisok közel fele van párosítva extra kar

11. Orvosi Nobel díj 1974 Kémiai Nobel díj 2009 Riboszóma Albert Claude Christian de Duve George E. Palade • Ribonukleoprotein • két alegység: 30S (kis) és 50S (nagy) (2500 kDa) • ribozim: katalitkus tulajdonságú RNS • 65% rRNS és 35% fehérje • Oldatban spontán felveszi a szerkezetét durvafelszínű endoplazmatikus retikulum Memo: Az alegységek méretét Svedberg egységben adják meg (S), ami a centrifugálás során tapasztalható szedimentációs tulajdonságára utal. Nem additív. Venkatraman Ramakrishnan Thomas A. Steitz Ada E. Jonath

12. 1. lépés: Aminosav aktiválás Adeniláció ATP 5’-aminoacil adenilát (aminoacil AMP) aminoacil tRNS szintetáz aminosav 20 aminosav

13. 1. lépés: Aminosav aktiválás Aminoaciláció • Szükséges, hogy a helyes aminosav kötődjön az adott tRNS-hez • minden aminosavhoz külön tRNS szintetáz 5’-aminoacil adenilát (aminoacil AMP) aminoacil tRNS szintetáz tRNS

14. 1. lépés: Aminosav aktiválás Aminoaciláció • A riboszóma már nem ellenőrzi az aminosav helyességét • a tRNS szintetáznak kell megkülönböztetnie az aminosavakat és a tRNS-eket! a tRNS 3’ vége aminoacil csoport 5’ vég aminoacil tRNS szintetáz aminoacilált tRNS

15. http://vcell.ndsu.edu/animations/translation/index.htm

16. 5’ UTR 3’ UTR az mRNS „olvasható” része: kodonok eukarióta mRNS 3’ UTR: poliadenin metilált 5’ vég az mRNS stabilitásához szükséges az 5’ UTR régióhoz kötődik a riboszóma kis alegysége a riboszóma továbbhalad az mRNS-en egészen az első kodonig (AUG)

17. 2. lépés: Iniciáció • A riboszóma 30S alegysége iniciációs faktorokhoz, majd az mRNS-hez kötődik • Az IF faktorok meggátolják, hogy az 50S alegységgel komplexet alkosson • Az 5’ UTR régió speciális szekvenciája irányítja a riboszómát az AUG szekvenciához • GTP adja az energiaforrást • A fehérjeszintézis mindig a fehérje N-terminálisával kezdődik, és a karboxi-terminálison növekszik a peptidlánc • Az első aminosav egy metionin vagy formilmetionin (baktériumoknál, mitokondiumban stb.), amit külön Met-tRNS hordoz 30S alegység

18. kodon és antikodon egymással komplementerek anti kodon aminoacil tRNS AUG  metionin miután bekötött az első tRNS, a riboszóma nagy alegysége is rákapcsolódik az mRNS-re a riboszómának két fontos aktív helye van: Peptidil (bal) és az Aminoacil (jobb)

19. az első tRNS a P a második az A helyet foglalja el az A tRNS-sének aminosavja (NH2 csoport) SN reakcióval átveszi a P tRNS aminosavját

20. 3. lépés: Elongáció 23S rRNS • következő tRNS kötődése (GTP) • peptid kötés kialakítása (ribozim katalizálta reakció) • transzlokáció (GTP)

21. 3. lépés: Elongáció

22. az első tRNS a P a második az A helyet foglalja el az A tRNS-sének aminosavja (NH2 csoport) SN reakcióval átveszi a P tRNS aminosavját a P helyről távozik a tRNS mindig a kodonnak megfelelő tRNS érkezik, és a megfelelő aminosavval bővül a peptidlánc a riboszóma tovább halad, az eddigi A helyen levő tRNS most a P helyre kerül új tRNS érkezik, új peptid kötés alakul ki

23. a peptidlánc növekszik a riboszóma addig halad tovább, amíg egy stop kodonhoz nem ér ekkor nem egy tRNS, hanem egy leoldó (releasing) faktor köt az A helyre a riboszóma nem képes továbblépni a peptid leválik az utolsó tRNS-ről, és elhagyja a riboszómát a riboszóma alegységeire esik szét

24. 4. lépés: Termináció • UAA, UAG vagy UGA kodonoknál megáll a fehérjeszintézis • RF1 az UAA vagy az UAG, RF2 az UAA vagy UGA kodonok helyére köt • RF tRNS-re hasonlító fehérje HF: Milyen aminosav szekvenciát kódol az alábbi mRNS szakasz? Mi lenne a következménye az A  G mutációnak a nyíllal jelölt helyen? mRNS 5’ AACUGCACGAGGUAACACAAGAUGGCU 3’ A

25. Szintetikus Kémiai Biológia Nem-természetes aminosavat tartalmazó fehérjék bakteriális expressziója Kvvn9756/1 A modern kémia problémái 2011. november 9.

26. Miért van szükség módosított fehérjékre? • A természetes fehérjék is átesnek poszttranszlációs módosuláson: • Glikolizáció • Foszforiláció • Metiláció, hidroxiláció • Diszulfid híd • A prokariótában expresszált fehérjéket in vivo bonyolult poszttranszlációsan módosítani • Biokémiai kérdések megválaszolása kedvéért • Szerkezeti információ • Stabilitás • Reaktivitás • Spektroszkópiai próbák • FRET: fluoreszcens próba Hogyan építhetünk be nem-természetes aminosavat a fehérjébe? • Totál szintézissel • Expresszált fehérje ligációval • Kiterjesztett genetikai kóddal

27. Izoszterikus aminosav beépítése ATP metionin tRNS szintetáz • Az aminoacil tRNS szintetáz becsapható hasonló méretű és alakú aminosavval • Olyan E. coli törzs kell hozzá, amelyik nem tud metionint szintetizálni (metionin auxotróp) • Ha az E. coli-t olyan táptalajban növesztjük, amihez metionint adtunk, akkor ezt a metionint beépíti a szervezetébe

28. Izoszterikus aminosav beépítése ATP metionin tRNS szintetáz • Az aminoacil tRNS szintetáz becsapható hasonló méretű és alakú aminosavval • Olyan E. coli törzs kell hozzá, amelyik nem tud metionint szintetizálni (metionin auxotróp) • Ha az E. coli-t olyan táptalajban növesztjük, amihez azidohomoalanint adtunk, akkor ezt az aminosavat beépíti a szervezetébe a metioninok helyére Hátrányok: Mindig egy meglevő aminosav helyére lehet az új aminosavat beépíteni, így nincs 21-dik aminosav. Csak kevés aminosavval működik. Több helyre is beépül az új aminosav.

29. Feltételek egyedi kodon a 21-dik aminosav számára komplementer aminoacil tRNS Megoldás STOP kodon aminoacil tRNS mesterséges szintézise 74-mer szintézise biológiailag DNS templáttal (más organizmusból) aminoacil-dinukleotid szintézise kémiailag RNS ligázzal összekapcsolni Hogyan lehet egy 21-dik aminosavat beépíteni a fehérjébe? mRNS stop kodon

30. Stratégia Módosítsuk a fehérjét kódoló DNS kodonját a mesterséges aminosav helyén egy STOP kodonra (TAG) Az E. coli sejteket falait bontsuk fel úgy, hogy egy „in vitro” expressziós rendszert kapjunk Ekkor a transzkripció és a transzláció is a kémcsőben történik Adjuk a rendszerhez a mesterséges tRNS-t A riboszóma folytatni fogja a fehérjeszintézist, és nem áll meg az UAG stop kodonnál Hogyan lehet egy 21-dik aminosavat beépíteni a fehérjébe?

31. Ritka DNS kódolt aminosavak • Néhány anaerob archaea és egy ismert baktérium kódol pirrolizint. • Metán metabolizmus enzimének aktív helyén található. • Van saját pirrolizil-tRNS szintetáz enzime, ami a pirrolizilt szállító tRNS-hez köti. UGA stopkodon kódolja UAG stopkodon kódolja Monometilamin metiltranszferáz (PDB: 1L2Q)