enzymy

1. Zdravotnická škola, Hradec Králové Stredná zdravotnícka škola, Bánská Bystrica enzymy klinicko-biochemická diagnostika a metody stanovení

2. první zmínky již v 18. století, byly spojovány s kvasnými procesy (název - fermenty) 1835, Berzelius 1860, Pasteur historie – schopnost sladu štěpit škrob, první teorie katalýzy – kvašení způsobeno fermenty, spojeno s buňkou en.wikipedia.org/wiki

3. 1878, F. W. Kühne 1926, J. Sumner historie zaveden výraz enzym (en zymé – řecky „v kvasnicích“ – odkud byly poprvé izolovány) prokázána bílkovinná povaha enzymů izolací ureázy ze sojových bobů (první enzym v krystalické podobě) en.wikipedia.org/wiki

4. rozvoj poznatků o struktuře enzymů nastal až v letech 1960-1970, kdy došlo k zdokonalení analytických metod (kapalinová chromatografie, rentgenová strukturní analýza) 1986 - i-RNA může mít enzymatickou (katalytickou) funkci (tzv. ribozymy) dnes jsou známy tisíce enzymů, v každé buňce je více než 3000 enzymů historie

5. enzym biokatalyzátor - katalyzátor biochemické reakce v živých organizmech, jeho struktura je zakódována v DNA biomakromolekula - proteiny globulární struktura, Mr 104 – 106 jednoduché enzymy tvořené jen bílkovinou struktura

6. složené enzymy tvořené bílkovinnou (apoenzym) a nízkomolekulární částí (kofaktor) pevně vázaný - prostetická skupina slabě vázaný - koenzym kofaktory často tvořeny deriváty vitaminů (např. vit. B) příklady kofaktorů: NAD+, FAD, koenzym A kofaktory nedenaturují, určují, jaké atomy či skupiny se v reakci přenášejí metaloenzymy - v aktivním centru obsahují funkční kovové ionty (Mo, Cu, Zn, Fe ...) struktura

7. reakce se neúčastní celá molekula, jen část – nazývá se aktivní centrum většinou 1 aktivní centrum + regulační místa kofaktor substrát apoenzym aktivní centrum – prostorové uspořádání aminokyselin (jamka, štěrbina), kam se váže substrát, např. vodíkovými můstky kofaktory se váží také na aktivní centrum struktura

8. stejné vlastnosti zvyšují rychlost snižují aktivační energii neovlivní rovnováhu srovnání s anorganickými katalyzátory • odlišnosti • účinnější (stačí menší látkové množství) • specifita – enzymy katalyzují jen určitou reakci • účinek enzymu lze regulovat • pracují za mírných podmínek vnitřního • prostředí organizmu

9. enzymy - vlastnosti vysoká účinnost rychlost reakcí vyšší o 6-12 řádů vysoká specifita vzhledem k určitému substrátu - substrátová specificita(např. glukózooxidáza - GOD – katalyzuje jen oxidaci glukózy, ne jiného sacharidu) vzhledem k typu reakce – reakční specificita schopnost katalyzovat reakci v určitém místě substrátu – regiospecificita ovlivnění optické aktivity – stereospecificita

10. enzymy - vlastnosti mírné reakční podmínky teplota obvykle 20-40 °C tlak 0,1 MPa pH cca 7 regulace účinku katalýzy asociace (vznik multienzymových) komplexů

11. názvosloví enzymů triviální – in např. pepsin, fibrin přípona – asa (-áza) ke jménu příslušného substrátu(sacharasa/-áza) k označení reakce, tj. působení enzymu (reduktasa/-áza, transferasa/-áza)

12. klasifikace enzymové komise (EC-Enzyme Comission) uvádí označení každého enzymu čtyřmístným číselným kódem př. E.C. 1.1.1.27 znamená: názvosloví enzymů 1 1 1 27 • 1 na 1. místěoznačuje enzym 1. třídy, tj. oxidoreduktáza • 1 na 2. místěje podtřída způsobující oxidaci • primární alkoholové skupiny 1 na 3. místěznačí přítomnost pyridinového koenzymu 27 je pořadové číslo enzymu, tj. jedná se o laktát-dehydrogenázu

13. klasifikace enzymů dnes je známo přes 3000 různých enzymů, jsou klasifikovány podle reakcí, které katalyzují do 6 enzymatických tříd, jež jsou dále děleny na podtřídy, ty na skupiny a každý enzym má své pořadové číslo oxidoreduktázy katalyzují oxidačně-redukční procesy (tj. přenos kyslíku, vodíku, elektronů) transferázy katalyzují přenos funkčních skupin (např. -CH3, -NH2, glukózu, fosfát) z donorů na akceptory

14. klasifikace enzymů hydrolázy za účasti vody štěpí vazby vzniklé kondenzací (hydrolytické štěpení vazby, např. rozklad peptidových, glykosidických, esterových, fosfodiesterových); příkladem jsou trávicí enzymy lyázy (syntázy) katalyzují odštěpení malých molekul, nebo naopak jejich vnášení (nehydrolytické štěpení vazeb) izomerázy uskutečňují vzájemné přeměny izomerů, přenos skupin atomů v rámci jedné molekuly ligázy (syntetázy) vznik energeticky náročných vazeb za současného rozkladu látky uvolňující energii, za rozpadu ATP

15. rozdělení enzymů - dle místa působení intracelulární většina – jsou uvnitř buňky, ve které vznikly působí uvnitř buněk, jsou obsaženy v cytoplazmě nebo buněčných organelách buněčné trávení – hydrolázy v lyzozomech mitochondriální enzymy – např. při reakčním cyklu kyseliny citronové (Krebsův cyklus), odbourávání mastných kyselin mikrosomální enzymy – v hladkém endoplazmatickém retikulu (detoxikační procesy) extracelulární jsou z buněk vylučovány do extracelulárních tekutin (např. trávicí šťávy)

16. rozdělení enzymů – dle formy výskytu rozpuštěné imobilizované fixované na biologické struktury, např. buněčné membrány asociované tvoří multienzymové komplexy nereaktivní proenzymy (zymogeny) jsou vyráběny a vylučovány v neaktivní formě, teprve v místě působení se proteinlýzou přemění na aktivní formu izoenzymy katalyzují stejnou reakci, ale liší se v primární struktuře bílkovinné části, tedy i fyzikálně-chemickými vlastnostmi odliší se od sebe elektroforeticky, termostabilitou a různým vlivem inhibitorů (např. tartarát u ACP)

17. teorie katalýzy I nekatalyzované reakce probíhají 104 až 106 krát pomaleji, důvodem je jejich vysoká aktivační energie E*(energie, kterou musí molekula dosáhnout, aby došlo k chemické reakci) katalyzované reakce - probíhají ve dvou stupních • reakce substrátu s katalyzátorem (enzymem) • za vzniku aktivovaného komplexu 1. + S E-S • rozpad aktivovaného komplexu na produkt • a obnova původního katalyzátoru (enzymu) 2. + E-S P E E

18. teorie katalýzy I rychlost enzymově katalyzované reakce závisí na: množství substrátu a enzymu fyzikálně-chemických vlastnostech prostředí přítomnosti látek ovlivňujících činnost enzymů (aktivátory a inhibitory) • dochází ke snížení aktivační energie • a tím ke zrychlení reakce • katalyzátory zvyšují rychlost reakce • v obou směrech • katalyzátor se při reakci nemění a nemá vliv • na chemickou rovnováhu reakce

19. teorie katalýzy II aktivační energie nekatalyzované reakce E1* snížená aktivační energie při katalyzované reakci E2* reakční koordináta nekatalyzovaná reakce katalyzovaná reakce energie substrát (výchozí látka) substrát (výchozí látka) DGreakce produkt G-reakcezměna Gibbsovy energie (vyjadřuje samovolnost reakcí za konst. teploty a tlaku)

20. teorie katalýzy II změna Gibbsovy energie nekatalyzované reakce DG nekat.reakce změna Gibbsovy energie katalyzované reakce DG kat.reakce ES EP reakční koordináta nekatalyzovaná reakce katalyzovaná reakce volná energie (Gibbsova) substrát (výchozí látka) substrát (výchozí látka) produkt ES - komplex enzym-substrát EP - komplex enzym-produkt

21. mechanizmus působení enzymu teorie komplementarity (zámek a klíč) tato teorie byla formulována r. 1894 Fisherem, dnes již neplatí, uvádí se jen pro zjednodušení účinnost enzymu podmíněna aktivním centrem aktivní centrum svým tvarem a funkčními skupinami umožňuje vazbu určitého substrátu enzym (zámek), substrát (klíč) aktivní centrum umožní účinnou orientaci reagujících látek

23. mechanizmus působení enzymu teorie indukovaného přizpůsobení (induced fit) – Koshland, 1959 aktivní centrum tvaruje se až v kontaktu se substrátem je tvarově poměrně přizpůsobivé jeho tvar přesně odpovídá typu substrátu, katalyzované reakce a obsahuje přesně rozmístěné reakční skupiny přirovnává se k „ruce v rukavici“ (tj. změna tvaru rukavice)

25. faktory ovlivňující enzymatické reakce teplota se vzrůstající teplotou roste i aktivita enzymů až do teplotního optima(lidské enzymy 37 °C), při vyšší teplotě dochází k inaktivaci a degradaci pH enzymy mohou přijímat nebo odevzdávat protony, proto jejich aktivita závisí na pH; největší aktivita je v oblasti tzv. pH optima, které je charakteristické pro konkrétní enzym u většiny enzymů je pH optimum 5-7 (u některých enzymů se může tato hodnota lišit, např. pepsin 1-2, trypsin 8-11) množství enzymu a substrátu fyzikálně-chemické vlastnosti prostředí, ve kterém reakce probíhá, a přítomnost modifikátorů

26. teplotní optimum oblast destrukce enzymu rel. aktivita 10 20 30 37 40 50 60 t [°C] faktory ovlivňující enzymatické reakce- teplota

27. -AMS pepsin ALP ACP relativní aktivita 0 2 4 6 8 10 12 14 pH faktory ovlivňující enzymatické reakce- pH

28. efektory (modifikátory) jedná se o látky ovlivňující enzymatickou aktivitu aktivátory – pozitivní efektory látky zvyšující enzymatickou aktivitu; mohou to být organické látky nebo anorganické ionty (Ca2+, Mg2+, Zn2+) tyto ionty nejsou pevně vázané na enzym, jako je tomu u metaloenzymů

29. efektory (modifikátory) inhibitory – negativní efektory látky snižující enzymatickou aktivitu kompetitivní inhibitory (soutěživé - vratné) - struktura inhibitoru je podobná substrátu, inhibitor tedy konkuruje substrátu v reakci nekompetitivní inhibitory (nevratné)- vážou se mimo aktivní centrum a změní tak jeho vlastnosti (tvar, rozmístění funk. skupin), funkční skupiny jsou trvale zablokovány (kationty těžkých kovů, katalytické jedy) akompetitivní inhibitory – vážou se až po vazbě enzymu na substrát, ten se pak nemůže rozpadnout na produkt a enzym

30. kinetika enzymatických reakcí I × [ ] V S max = v 0 + ] S K [ m maximální rychlost Vmax. ½ Vmax. KM Michaelisova konstanta [S] koncentrace substrátu závislost rychlosti enzymatické reakce na koncentraci substrátu Rovnice Michaelise a Mentenové: ověřovali štěpení sacharózy pomocí fruktofuranózy – efekt konst. konc. S za změn množství enzymu a konst. množství enzymu za změn S; rovnice vyjadřuje závislost rychlosti enzymatické reakce na koncentraci substrátu (dosáhne-li substrát dostatečné koncentrace, aby vznikl komplex ES, je další krok určující rychlost reakce necitlivý k dalšímu zvyšování množství S (Vmax – enzym nasycen S)

31. kinetika enzymatických reakcí II rychlost enzymatické reakce závisí na koncentraci substrátu (za konstantní koncentrace enzymu) Michaelisova konstanta Km(mol/l) udává koncentraci substrátu, při níž je rychlost reakce poloviční limitní rychlosti reakce (Vmax) tato konstanta nezávisí na koncentraci enzymu je mírou afinity daného enzymu k substrátu (čím je Km nižší, tím je afinita E k S vyšší) je to hodnota rozpadu komplexu ES závisí na koncentraci substrátu, pH, teplotě a modifikátoru slouží pro odhad koncentrace substrátu užívaného při stanovení enzymů

32. kinetika enzymatických reakcí III v0 kinetická rovnice 0. řádu kinetická rovnice I. řádu [S] saturační graf při nízké konc. S nepracují všechna aktivní centra enzymu a v0 roste s rostoucí konc. S až do obsazení všech aktivních center, poté reakční rychlost závisí na rychlosti vzniku a uvolnění P, tedy k měření katalytické aktivity se používá koncentrace substrátu v nadbytku

33. vyjádření množství enzymu v biologickém materiálu nepřímé stanovení katalytická koncentrace mkat/l stanoví se produkt enzymatické reakce většina klinicky významných enzymů

34. vyjádření množství enzymu v biologickém materiálu přímé stanovení hmotnostní koncentrace mg/l stanoví se molekula enzymu jako antigen (imunochemicky) jen některé enzymy v extrémně malých koncentracích (např. tumorové markery) stanoví se i molekuly, které ztratily katalytickou aktivitu (např. CK-MB)

35. katalytická aktivita enzymu zavedená jednotka katal, 1 kat [mol/s] jeden katal představuje katalytickou reakci enzymu, při které se za jednu sekundu přemění jeden mol substrátu (v praxi se používají mkat, nkat), u tělních tekutin je aktivita enzymu vztažena na 1 litr tekutiny, tj. mkat/l mezinárodní jednotka IU (international unit) 1IU [1mkat/min.] 1[mkat] = 60 [IU]

36. metody stanovení katalytické koncentrace enzymu kinetická metoda (předpokladem je lineární přírůstek produktu či úbytek substrátu) průběžně se měří [S], popř. [P], např. po 10 s řada měření zjistí se v0 z kinetické křivky přesná metoda reakce měření reakce měření reakce měření reakce měření

37. metody stanovení katalytické koncentrace enzymu metoda konstantního času (end point) měří se [P] po proběhnutí reakce jedno měření zjistí se průměrná rychlost [P]/ t méně přesná metoda reakce měření

38. měření katalytické aktivity katalytická aktivita se nejčastěji měří spektrofotometricky v závislosti na čase se sleduje A (absorbance) produktu (která je přímo úměrná jeho koncentraci, viz Lambert-Beerův zákon) při měření je důležitá temperace (teplota se musí pohybovat v teplotním optimu enzymu) D D c A = = kat [ ] D e × × D t l t

39. využití enzymů v klinické biochemii enzym jako indikátor patologického stavu při poškození buněk se zvyšuje aktivita intracelulárních enzymů v extracelulární tekutině enzymy jako analytická činidla Př: glukózaoxidáza pro stanovení koncentrace glukózy lipáza pro stanovení triacylglycerolů ureáza pro stanovení močoviny

40. klinickyvýznamnéenzymy

41. laktátdehydrogenáza (LD) • oxidoreduktáza • katalyzuje reakci přeměny kys. pyrohroznové (pyruvátu) • na kys. L-mléčnou (laktát) • (tj. poslední rovnice anaerobní glykolýzy) • LD má 2 podjednotky H (heart) a M (muscle), • je to tetramer, tvoří 5 izoenzymů: • LD1 (4 podjednotky H) • LD2 (3H 1M) • LD4 (1H 3M) • LD5 (4 podjednotky M) • LD3 (2H 2M) typ enzymu:

42. laktátdehydrogenáza (LD) • infarkt myokardu, nádorové onemocnění, • jaterní onemocnění, hemolytická anemie, leukemie klin. význam: fyziol. hodnoty: do 4,2 kat/l (37 °C) biol. materiál: krevní sérum interference: • hemolýza v buněčné cytoplazmě všech tkání vysoká aktivita v játrech (LD5), ledvinách, srdci (LD1), kosterním svalstvu (LD5), erytrocytech a nádorových buňkách lokalizace:

43. alaninaminotransferáza (ALT) • cytoplazmatický enzym • játra, ledviny, srdce, kosterní svalstvo, pankreas, • slezina a plíce lokalizace: • poškození jater (hepatopatie)- infekční virová hepatitida, • infekční mononukleóza (až 20x vyšší aktivita), • chronická onemocnění jater • poškození svalstva (úrazy, záněty) • dekompenzované srdeční vady klin. význam: typ enzymu: • transferáza • katalyzuje přenos aminoskupiny na 2-oxoglutarát • za vzniku pyruvátu a glutamátu

44. alaninaminotransferáza (ALT) muži <0,75 kat/l ženy <0,58 kat/l fyziol. hodnoty: krevní sérum biol. materiál: interference: • hemolýza

45. aspartátaminotransferáza (AST) • 65 % v cytoplazmě (cytoplazmatický izoenzym) • 35 % v mitochondriích (mitochondriální izoenzym) • játra, srdce, kosterní svalstvo, ledviny, erytrocyty lokalizace: typ enzymu: transferáza katalyzuje přenos aminoskupiny na 2-oxoglutarát za vzniku oxalacetátu a glutamátu

46. aspartátaminotransferáza (AST) <0,58 kat/l (37 °C) fyziol. hodnoty: biol. materiál: sérum, krevní plazma interference: hemolýza • onemocnění srdce - nekrózy provázející infarkt myokardu • onemocnění jater- infekční hepatitida (AST<ALT), • toxická forma hepatitidy (AST>ALT) • onemocnění kosterního svalstva: úrazy, • degenerativní svalové onemocnění • poměr AST/ALT – tzv. De Ritisův koeficient • pro infarkt myokardu • - do 0,7 (nekomplikovaný lehký průběh) • - nad 0,7 – nekróza, dále tento poměr • určí závažnost léze hepatocytů klin. význam:

47. g-glutamyltransferáza (GMT) • játra, epitel žlučových cest, ledvinové tubuly lokalizace: • jaterní onemocnění (poruchy cytoplazmatické membrány), • výrazné zvýšení aktivity GMT při poškození jater • alkoholem (cirhóza, steatóza jater) • maligní nádorová onemocnění – karcinomy pankreatu, jater klin. význam: <1.20 kat/l fyziol. hodnoty: biol. materiál: krevní sérum, plazma (protisrážlivé činidlo EDTA) transferáza katalyzuje přenos -glutamylového zbytku na jiný peptid typ enzymu:

48. kreatinkináza (CK) • cytoplazma a mitochondrie buněk kosterního svalstva, • srdce a mozku lokalizace: typ enzymu: • transferáza • katalyzuje vratnou fosforylaci kreatinu • za vzniku kreatinfosfátu a ADP (dle potřeb organizmu) • je aktivována Mg 2+ ionty • izoenzymy CK: • tvořen ze dvou podjednotek: • svalové M (muscle) • mozkové B (brain) • CK-MM: svalový, obsažen v kosterním svalstvu • CK-MB: srdeční (myokardní) hlavně v srdci • CK-BB: mozek • u zdravých osob v séru 95 % CK-MM • a 5 % CK-MB (CK-BB) se nevyskytuje

49. kreatinkináza (CK) • ♂ <3.2 kat/l (37 °C) • ♀<2,4 kat/l (37 °C) • CK-MB 6 % celkové aktivity CK fyziol. hodnoty: biol. materiál: krevní sérum, plazma (heparin) biologický CK-MB mass (g/l) – hmotnostní koncentrace celého proteinu, na rozdíl od běžného principu stanovení katalytické konc. CK MB je stanovení hmotnostní koncentrace CK MB mass v plazmě specifické právě pro izoenzym CK MB stanovováno u infarktu myokardu klin. význam: • onemocnění srdce: infarkt myokardu: po 4-8 hod. dochází • ke zvýšení aktivity CK-MB (důsledek nekrózy srdečního svalu) • k normálním hodnotám se vrací po 3-5 dnech; • pro diagnózu IM nemá význam celková aktivita CK, • protože převládá CK-MM, stanovuje se proto CK-MB • onemocnění svalů: úraz, zánět - zvýšená aktivita CK-MM • onemocnění CNS: aktivita CK-BB se zvyšuje úměrně • s poškozením CNS

50. alkalická fosfatáza (ALP) • izoenzymy ALP se nacházejí ve všech tkáních, • jsou složkou buněčných membrán lokalizace: • produkován osteoblasty při kostní mineralizaci • cholestáza - při stagnaci žluči (uzavření žlučových cest), • ALP ve žluči až 100x vyšší než v séru • nádorová onemocnění jater – výskyt atypických forem ALP • zánětlivá střevní onemocnění • kosterní procesy spojené s vyšší aktivitou osteoblastů klin. význam: • děti (1-10 let) 1,10-6,20 kat/l • děti (10-15 let) 1,40-7,50 kat/l • dospělí 0,70-2,20 kat/l fyziol. hodnoty: biol. materiál: krevní sérum, plazma (heparin) typ enzymu: • hydroláza • v alkalickém prostředí katalyzují hydrolýzu organických • monoesterů kyseliny fosforečné • ALP má 3 izoenzymy: • placentární • střevní • izoenzym v játrech, kostech a ledvinách