第九章 各种层析分离方法

1. 第九章 各种层析分离方法 教学目的 掌握凝胶过滤及离子交换层析的原理、特点； 掌握亲和层析与其它亲和分离方法的比较； 了解层析分离介质的种类 重点和难点 制备色谱分离技术的应用 课堂教学设计 课堂讲授、实例分析与学生自学相结合

2. 参考书目 1 刘国诠，生物工程下游技术，化学工业出版社 2 严希康，生化分离工程，高等教育出版社 3 孙彦，生物分离工程，化学工业出版社 教学时数6学时

3. 主要内容 • 概述 • 凝胶过滤 • 凝胶过滤介质 • 离子交换层析 • 离子交换层析介质 • 亲和纯化

4. 液相色谱法是分离纯化重要方法 在蛋白质及天然生物制品的分离纯化工艺中已获得应用 9.1 概述 生物技术领域 制药工业、合成化学 制备液相色谱获得蓬勃发展 生物技术工业高效分离纯化工具 生物技术的发展 许多以柱层析为基础的系统装置 1982年出现 快速蛋白质液相色谱系统（FPLC), 纯化生物大分子专用系统 采用凝胶过滤、离子交换、等电聚焦、亲和层析、疏水色谱色谱技术来生物大分子进行分离纯化

5. 分离方法 分离原理 特点 应用 凝胶过滤 根据分子大小 1分辨率为中等， 脱盐效果优良。 2流速较低，对分级每周期约≥8h，脱盐仅30min 3容量受样品体积限制 适于大规模纯化的最后步骤，在纯化过程的任何阶段均可进行脱盐处理，尤其适于两种缓冲液交替时 离子交换 电荷 1通常分辨率高。2选用介质的流速快、容量高，样品体积不受限制 最适用于大量样品处理的前阶段 聚焦色谱 等电点 1分辨率高。2流速快。3容量高，但柱的大小限制样品体积 适于纯化的后阶段 疏水色谱 疏水性 1分辩率好。2流速很快。3容量高，样品体积不受限制 适用于分离的任何阶段，尤其当样品离子强度高时，即在盐析、离子交换或亲和层析后用 亲和色谱 亲和性 1分辨率非常高。2流速高，样品体积不受限制 适于分离纯化任何阶段，尤其是样品体积大、浓度很低而杂质含量很高时 9.1.1 各种色谱方法比较

6. (瑞典的全自动生产规模层析) 9.1.2 Bioprocess 标准系统 • 最大特点: 核心部分（层析分离单元）可以就地清洗，保证系统在无菌条件下工作，清洗方便。 • 可进行公斤级生产。 • 它有Bioprocess I和 Bioprocess II两种型号，其流速分别为4－20 l/h 和40－400 l/h，用于中试及大规模生产。

7. 凝胶过滤 利用凝胶的网状结构,根据分子大小进行分离的一种方法 概念 9.2 凝胶过滤(分子筛层析)

8. 样品 进入 层析柱 较大分子 较小分子 更小分子 通过任意孔道扩散 不能通过孔道扩散 进入珠体内部 不能进入凝胶珠体内部 通过部分孔道 小分子向柱下的移动最慢，中等分子次之， 流动相一起流出层析柱 样品根据分子大小不同，依次顺序从柱内流出，达到分离目的 1 基本原理

9. 2 凝胶过滤优点： 1介质为不带电的惰性物质，不与溶质分子作用 分离条件温和，蛋白质不易变性，收率高，重现性好。 2工作范围广，分离分子量的覆盖面大， 3设备简单，易于操作，周期短. 4 分离之后不需再生，可连续使用. 有的可连续使用几百次

10. 通常用于经过浓缩后的样品。 上样量小 用于初步纯化和中后期脱盐 3 凝胶分离用途 • 脱盐 • 分级分离 无机盐与生物大分子的分离； 将分子大小相近的物质分开，通常为大分子间的分离 • 进行多肽、蛋白质及核酸等物质分子量测定 • 缓冲液的置换。

11. 4 凝胶过滤应注意的事项 • 作为下游最终精细纯化步骤. 上样量小，分辩率高 • 在应用过程中以分辨率、流速、耐用性及蛋白的回收率全面的评价介质的性能。 • 装柱是影响分离效果的重要步骤 • 避免非特异性吸附，在缓冲液中加入0.1－0.2M的氯化钠

12. 根据样品组分情况选择分离范围与分子量相近的介质好根据样品组分情况选择分离范围与分子量相近的介质好 分离样品 要求精细分离的样品 处理量较大的样品 分子量分布广 成分简单 选用粒径较大且分辨率高的介质 应选用粒径较大，流速较快的介质 采用分辨率高的凝胶分离 采用分离范围广的凝胶分离

13. 9.3 凝胶过滤介质 为了满足近年生物技术以制备为目的的需要，出现许多Bioprocess凝胶。既有凝胶过滤介质也有离子交换介质，此类凝胶的主要特点: 1适用于实验室及大规模的工业生产，在使用中有较高的重现性。 2便于清洗、消毒及再生，介质的使用寿命较长，有优良的化学物理稳定性 3易于装柱，有较高的动态干燥容量，流速较快，有利于工业生产。

14. 1 凝胶过滤介质应具备的条件 （1）凝胶介质为惰性物质 （2）介质内所含的带电基团应尽量少。 （3)介质内孔径应分布均匀。 （4）介质粒径的均一性好。 (5) 介质要有优良的物理化学稳定性较高的机械强度

15. 2 凝胶过滤介质的种类 凝胶介质的骨架主要为天然多糖类及合成大分子两大类 1)多糖类骨架介质：亲水性 • 纤维素凝胶 • 葡聚糖凝胶（sephadex） • 琼脂糖凝胶（sepharose）

16. 2)合成大分子骨架介质（为了克服微生物的侵蚀）2)合成大分子骨架介质（为了克服微生物的侵蚀） 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel P） 琼脂糖和葡聚糖组成的复合凝胶（Superdex） 3)生物大分子和合成高聚物构成的混合骨架的介质

17. 牌号 骨架类型 生产单位 Sephadex 葡聚糖 Ameisham Pharmacia（瑞典） Sepharose 琼脂糖 Bio-Gel A 琼脂糖 Bio-Rad（美国） Superdex 琼脂糖－葡聚糖 Ameisham Pharmacia Bio-Gel P 聚丙烯酰胺 Bio-Rad Sephacryl 葡聚糖－聚丙烯酰胺 Ameisham Pharmacia Fupergit C 聚丙稀酰胺系 德国 Toyopearl 聚乙烯醇系 TosoHaas(日本) Bio-BeadsS-X 聚苯乙烯系 Bio-Rad 主要凝胶过滤介质的牌号及骨架结构

18. 9.4 离子交换层析 以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离物的各种离子结合力的差异，而将混合流动相中不同离子进行分离的层析技术。 9.4.1 概念 • 离子交换层析 离子交换介质基本性质 • 离子交换剂 一类能显示离子交换的功能高分子材料。 如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等 由固定在骨架上的带电基团与可进行交换的能移动离子二部分组成。 • 功能基 二者所带电荷相反，静电结合，交换可逆

19. 9.4.2 生物大分子分离纯化方式 正吸附 负吸附 将目的产物离子化，被交换到介质上，杂质不被吸附而从柱流出 将杂质离子化后被交换，而目的产物不被交换直接流出 可除去50－70％杂质，适于目的产物浓度高工作液，产物纯度不高。 目的产物纯度高，可达到浓缩的目的。 宜处理目的产物浓度低、工作量大的溶液

20. 9.4.3 生化用离子交换剂特点 生化分离体系复杂， 大分子受微环境影响大 分子构象易变 分离活性大分子的生化专用介质: 特殊性能。 • 亲水性及相容性 • 孔结构 • 电荷密度 • 粒度 • 纯度

21. 亲水性及相容性 疏水型 亲水型 有活性生物大分子适宜环境 离子交换剂骨架 溶胀 亲水胶 以天然大分子为主 离子交换剂 亲水 生物专用介质 生物相容性好

22. 孔结构 凝胶孔 大孔树脂 琼脂糖介质孔 大分子链间孔 骨架具有毛细孔结构. 琼脂糖胶束构成 离子交换剂具有分子筛和离子交换双重作用 孔径分布均匀

23. 生物大分子 离子交换介质 多点结合 发生构象变化 结合牢固 难洗脱 失活 不可逆吸附 • 电荷密度 生物用离子交换树脂电荷密度适宜, 利于生物大分子的分离纯化

24. 分布越均匀， 理论塔板值越高， 分离效果越好 介质粒径越小 • 粒度 生物大分子扩散速度小，运动阻力大 被交换的溶质在珠体内扩散路径变短 粒径变小 交换速度增大 生物专用离子交换剂显著特点：粒径小，一般在20－300μm

25. 纯度 工业级 分析级 生物技术级 分子生物级（DNA级）

26. 离子交换层析分辨率高、工作容量大且易于操作，离子交换层析分辨率高、工作容量大且易于操作， • 离子交换剂通过交换和再生可以反复使用 蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种主要方法 生化分离中约有75％工艺采用离子交换法

27. 蛋白质－两性化合物 pH高于等电点 于等电点 pH低于等电点 带负电 带正电 宏观不带电 不进行交换反应 与阴离子交换剂进行交换 与阳离子交换剂进行交换 稳定存在 既可用阳离子交换剂也可用阴离子交换剂进行交换 9.4.4 生物大分子离子交换机理及离子交换剂选择 1 蛋白质带电性

28. 两种以上的成分被吸附在离子交换剂上 各自反应的平衡常数 洗脱液洗脱 各成分被洗脱－可能性 不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大小有差异， 吸附在离子交换剂上的蛋白质 改变pH NaCl 吸附蛋白质失去电荷解离下来/取代 选择适当洗脱条件便可将混合物中的成分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的

29. 3. 交换剂选择原则 自身pI 所处环境 交换剂选择 工作液pH 杂质带电情况 一般原则

30. 对pI=5酸性蛋白质 (在pH5.5-9.0范围)， 蛋白质为阴离子， 应首选DEAE纤维素； (在pH3.5-4.5范围) 当蛋白质为阳离子时， 应首选CM纤维素

31. 4 离子交换剂的强弱性 阳 阴 • 阳离子交换剂： 可与 离子进行交换反应的介质 阴离子交换剂 强性离子交换剂应用pH范围较广， 弱性离子交换剂的使用pH范围较窄。 • 离子交换剂表观电离常数 pK 判断 离子交换剂pH适用范围及洗脱剂选择 • 低pH值（<3.0） • pH值（>10.0） 选用强酸性介质 不宜用弱酸性介质 宜用强碱性介质 不宜用弱碱性介质

32. 5选择适宜工作条件，提高工作容量 一种聚电解质， 功能基种类决定其电性能 离子交换剂 全交换容量 功能基多少决定其交换能力 工作交换容量

33. 每克干介质或每毫升湿介质具有的功能基含量 • 全交换容量 • 离子交换剂的基础参数, • 每一种离子交换剂全交换容量值为定值, 由骨架决定 通用型离子交换剂的全交换容量较高， 生化专用介质的全交换容量较低（葡聚糖系除外）

34. 工作容量 所用的缓冲液的种类、工作液的pH/杂质存在情况及流速等 • 动力学容量，变量，表明有效容量时应附有实验条件。 • 在柱中操作时与流速有关。 指每克干介质或每毫升湿介质在一定操作条件下交换吸附蛋白质的实际容量

35. 9.4.5 离子交换层析基本操作 层析柱平衡 • 平衡缓冲液用量至少为柱体积2 倍 • 平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速 • 平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要 样品进柱 为了达到满意分离效果，进样量一般为介质交换容量10-20% 为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高

36. 样品洗脱 恒定洗脱 阶段洗脱 梯度洗脱

37. 9.4.6 离子交换分离介质使用应注意问题 1 预处理 提高其工作容量，还可提高被分离产品的纯度。在预处理最后阶段应使其转为分离过程中适用的离子形式。 需要有机溶剂(乙醇、丙酮等)处理除去生产过程中所用有机溶剂。 去除生产、包装过程中混入的杂质，通常使用酸碱处理. • 工业级 必须预处理 • 大孔型树脂 使其与缓冲液进行平衡，尽量减少分离过程中pH值的变化 • 生化专用型

38. 2 装柱 使介质在柱中分布均匀， 不允许气泡存在， 防止产生分层现象。 装柱好坏对分离有一定影响 3 流速－影响分离效果的一个重要因素 不但影响交换吸附效果， 同样影响洗脱效果 由于生物大分子扩散速率较慢，流速不宜过快 通常洗脱速度要慢些

39. 离子交换剂失效后，应进行洗脱 4 洗脱及再生方式 • 洗脱的目的 • 将吸附交换到颗粒内、外表面上的蛋白质解吸。 • 有多种蛋白质被吸附，如果采用一个恒定的洗脱条件，往往不能将所有的组分适当分开，需要改变洗脱条件 • 不同物质所用的洗脱剂不同，(用一种比吸着物质更活泼的离子或基团把吸着物置换下来) 洗脱剂选 择方法 • 应选择适当的洗脱剂，将蛋白质从介质上洗下，收集到分离纯化的产品。 顺流洗脱与逆流洗脱

40. 5 消毒及树脂的复苏 • 某些纯度要求较高的产品制备过程中，要求对分离介质进行消毒处理，以防微生物等杂质混入产品中 • 目前多数离子交换剂由于具有稳定的物理化学性能，可以进行消毒处理。 • 树脂中毒：使离子交换剂在工作过程中出现工作容量下降及难以洗脱等弊病。

41. 中毒原因： 1大分子的多点带电，与介质之间进行多点结合，难以进行洗脱，使有效功能基减少。 2一些分子较大在孔道内被卡牢，难以扩散出来，堵塞孔道，在以后的交换过程中影响孔内功能基工作。 3 工作液中的胶状物质被黏附在介质珠体表面，覆盖了功能基。

42. 9.5 离子交换层析介质 9.5.1 生化专用离子交换介质 • 主要用于生化领域，其它领域应用极少， • 粒径较小， • 售价比通用型树脂高很多. 目前，在生化专用离子型交换介质中以多糖类骨架为主，一般是过滤介质的衍生物。 其骨架结构、粒径、排阻极限等性能与母体相同。

43. 纤维素类 葡聚糖系离子交换介质 琼脂糖系 聚乙烯醇系 苯乙烯系 STREAMLINE系列（扩张床吸附专用） Mono Beads 系 聚丙烯酸羟乙酯系

44. 离子交换剂可解离基团

45. 1 纤维素类 携带功能基团纤维素衍生物，生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂 • 最早用于分离生物大分子的介质，具有松散的亲水网络，大孔隙、表面积大的优点。 • 以无定型为主，不利于柱式操作。 • 用量逐渐减少 微晶纤维素经交联及功能基化 而制备 珠状离子交换纤维素

46. 阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等 阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤维素）

47. 凝胶过滤介质 Sephadex G25 G50 引入功能基 多种离子交换介质 2 葡聚糖系离子交换介质 离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（Sephadex G） 葡聚糖系离子交换介质以Amersham Pharmacia公司生产的Sephadex 系产品为主

48. Sephadex优点： 亲水性强、不会引起生物分子变性和失活，母链对蛋白质、核酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小；电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快。 既有离子交换作用，又有分子筛作用 Sephadex是一类广泛应用的色谱分离介质 常用离子交换葡聚糖： 阳离子交换剂： CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50 Sephadex C-25，Sephadex C-50 阴离子交换剂： DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-50 QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50

49. 3 琼脂糖系 琼脂糖凝胶介质上引入功能基可得到多种离子交换剂 携带DEAE或CM基团的Sepharose CL-6B DEAE-Sepharose（阴离子型）和CM-Sepharose（阳离子型） 的离子交换介质 具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点。 介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因此具有稳定的外形体积

50. 胺化 羧酸化 羧、胺化 磷酸化 环氧化 酰肼化 DEAE离子交换剂 CM离子交换剂 鳌合介质 珠状凝胶 膦酸基离子交换剂 含环氧基中间体 制备亲和吸附剂 含－C(O)-NH-NH2基团的亲和吸附剂 4 聚乙烯醇系 Toyopearl 为全合成离子交换剂，具有稳定的结构，离子强度及溶液的pH变化对床体积影响很大.