Automatisatie van immunofluorescentie op paraffinecoupes en vriescoupes van nierbiopten

1. Automatisatie van immunofluorescentie op paraffinecoupes en vriescoupes van nierbiopten met de Benchmark XT Door Tracy Rogiers Dienst pathologische anatomie Dr. P. De Paepe en De heer T. Pont

2. Inleiding • glomerulaire filter • Immuuncomplexen • Glomerulonefritis • Principe van de IF kleuring op de Benchmark XT • Methode • Immunofluorescentie op vriescoupes • Immunofluorescentie op paraffinecoupes • Resultaten • Staal 07B 3915 • Staal 08B 1345 • Staal 08B 3740 • Staal 08B 4258 • Conclusie 1

3. Inleiding De glomerulaire filter • 3 compartimenten: • Subendotheliale ruimte en glomerulaire basale membraan • Subepitheliale compartiment • Mesangium 2

4. Inleiding Immuuncomplexen Met immunofluorescentie gaat men immuuncomplexen gaan opsporen die IgA, IgG, IgM, C1q, C3, kappa- en lambdaketens bevatten 3

5. Inleiding Glomerulonefritis Casus Patiënt, 54 jr. oud gekend voor SLE heeft veel eiwitverlies in de urine en de nierfunctie gaat achteruit. Bij immunofluorescentie onderzoek van het nierbiopt zijn er overwegend mesangiale en hier en daar deposities t.h.v. de capillaire wand van IgA, IgG, C1q, C3, kappa en lambda zichtbaar. IgG is moeilijk interpreteerbaar. Alles wijst op een ‘full house’ wat verwacht wordt bij SLE. Conclusie: Lupusnefritis klasse III tot IV 4

6. Inleiding Principe van de IF kleuring met de Benchmark XT VENTANA Benchmark XT Directe immunofluorescentie 5

7. Methode Immunofluorescentie op vriescoupes • Manuele FITC kleuring • Dakocytomation polyklonaal FITC – gelabelde konijnen antilichamen • Geautomatiseerde FITC kleuring met VENTANA Benchmark XT • VENTANA polyklonaal FITC – gelabelde schapen antilichamen 6

8. Methode Immunofluorescentie op vriescoupes Aangepaste incubatietijden van de verschillende VENTANA FITC –gelabelde primaire antilichamen 7

9. Methode Immunofluorescentie op paraffinecoupes • Geautomatiseerde FITC kleuring met VENTANA Benchmark XT methode 1 • Zelfde procedure als voor de geautomatiseerde IF kleuring op vriescoupes • Met als verschil formolfixatie en paraffine-inbedding • Geautomatiseerde FITC kleuring met VENTANA Benchmark XT methode 2 • Zelfde procedure als voor de manuele IF kleuring op paraffinecoupes • Met als verschil de IF kleuring gebeurt op de Benchmark XT 8

10. Methode Immunofluorescentie op paraffinecoupes • Geautomatiseerde FITC kleuring met VENTANA Benchmark XT methode 3 • Gebruik van een bestaand protocol voor op paraffinecoupes • Met als verschil aanpassing van de incubatietijd voor het enzym en de FITC – gelabelde antilichamen 9

11. Resultaat : Staal 07B 3915 A. Gekend resultaat voor immunofluorescentie: IgA nefropathie. B. Resultaat manuele IF kleuring op vriescoupes: 10

12. Resultaten: Staal 07B 3915 • C. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op vriescoupes met de VENTANA Benchmark XT: • Niet te beoordelen • D. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op paraffinecoupes met de VENTANA Benchmark XT methode 1: • Niet te beoordelen Depositie van IgA 11

13. Resultaat: Staal 08B 1345 A. Gekend resultaat voor immunofluorescentie:Diffuse glomerulonefritis met tekens van focale sclerose. B. Resultaat manuele IF kleuring op vriescoupes: 12

14. Resultaat: Staal 08B 1345 • C. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op paraffinecoupes met de VENTANA Benchmark XT methode 1 en 2: • Niet te beoordelen Depositie van C3 13

15. Resultaat: Staal 08B 3740 A. Gekend resultaat voor immunofluorescentie: lupusnefritis klasse III tot IV (A/C) B. Resultaat manuele IF kleuring op vriescoupes: 14

16. Resultaat: Staal 08B 3740 • C. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op paraffinecoupes met de VENTANA Benchmark XT methode 1: • Niet te beoordelen Depositie van IgM 15

17. Resultaat: Staal 08B 4258 A. Gekend resultaat voor immunofluorescentie: Gekende SLE klasse IIIC B. Resultaat manuele IF kleuring op vriescoupes: 16

18. Resultaat: Staal 08B 4258 • C. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op paraffinecoupes met de VENTANA Benchmark XT methode 1: • Niet te beoordelen Depositie van C1q 17

19. Conclusie • Naar aanleiding van de gedeeltelijke automatisatie van immunofluorescentie op paraffinecoupes en vriescoupes van nierbiopten met de Benchmark XT vertoonde de FITC kleuring op de vriescoupes het beste resultaat. Dit in tegenstelling tot de kleuring van de paraffinecoupes waarbij het weefsel volledig aankleurde of helemaal niet. • Om een geautomatiseerde immunofluorescentie op paraffinecoupes uit te voeren moet er een geschikt protocol aanwezig zijn in de software van de Benchmark XT. Aanpassingen aan bestaande protocols leverde niets op. • De poging om te automatiseren is dus niet compleet geslaagd. 18