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P-53

P-53. P-53 Se descubre en 1979 oncogen (forma mutada e inactiva ) Gen supresor de tumores Integridad genómica Control en la progresión del ciclo celular Sobrevida celular. P-53. Presenta varias isoformas N- p53 carece dominio N terminal ( 40/47kDa)

Patman
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  1. P-53

  2. P-53 • Se descubre en 1979 oncogen • (forma mutada e inactiva ) • Gen supresor de tumores • Integridad genómica • Control en la progresión del ciclo • celular • Sobrevida celular

  3. P-53 • Presenta varias isoformas • N-p53 carece dominio N terminal ( 40/47kDa) • Actua como inhibidor dominante negativo de la Full Lenght p53

  4. IRES ( internal ribosomal entry sites ) • Iniciacion de la traduccion CAP • independiente (1988 picornavirus) • Union directa de subunidad ribosomal • 40s en un sitio interno sobre mRNA • Se define por su funcion • Tiene codon de iniciacion AUG • Utilizacion de factores de iniciacion • (ITAF )

  5. IRES ( internal ribosomal entry sites ) • Se reconoce a traves de ensayos • utilizando construcciones bicistronicas • Dos genes reporteros bajo un mismo • promotor ( luciferasas ) • Entre ambos la zona de probable IRES • El primer reportero se va a traducir • utilizando la estructura CAP,luego hay STOP • Si encuentro el producto del segundo • mensajero es que esa secuencia es un IRES

  6. Los autores proponen que la traduccion en ambas isoformas se realiza a traves de dos IRES • 5’ UTR para full-lenght • Protein coding region para N-p53 • Con distinta actividad en el ciclo celular

  7. Objetivo: • Identificacion de las secuencias IRES • Ubicación en la secuencia completa del gen P-53

  8. MFOLD algoritmo : estructuras secundarias • 134 nt 5’ UTR • 5’ 251 nt

  9. Metodo : Transcripcion In Vitro • Plasmido monocistronico • GFP gen reportero ( downstream ) • RNA polimerasa T7 • Presencia / ausencia de analogo de CAP

  10. Metodo: • Transfecciones utilizando construcciones monocistronica • DNAs 5’251 y 134 nt P-53 RNAm de sangre de individuos sanos • Clonado en el vector pCDNA 3 con GPF • HCV – IRES - GFP

  11. Al agregar analogo de CAP : • No inhibe la traducccion del +39 • Inhibe parcialmente la –1 • Si inhibe a la GFP - CAP

  12. resultado • Con o sin analogo de CAP se observa traduccion • Estos resultados indican que el p53+39 y –1 permiten el inicio de la traduccion CAP independiente ( dos sitios IRES )

  13. Objetivo: comprobar que el inicio de la traducción de la proteína P53, se realiza mediante IRES, en el extremo 5’ UTR. Material y métodos: se utilizo plasmidos bicistronicos, con 2 genes reporteros Rluc y Fluc, promotor y secuencia P53 +1, P53 +39.

  14. 2da Hipótesis: descartar que las secuencias 5’UTR P53, no se Realiza a través de la lectura ribosomal Cap dependiente. 2do plasmido denominado PrDEp53(+39) y PrDEp53(+1), Se agrego secuencia regulatoria del virus de la encéfalo miocarditis que inhibe la traducción por CAP y un control interno con PrDEF

  15. Luego se descarto la traducción del 2do cistron, colocando el EMCV Rio arriba

  16. resultado La traducción de P53 (+39) y P53(+1) se realizo a partir del IRES en la posición 5’UTR.

  17. 3ra hipótesis:descartar que la traducción mediada por p53 (+39) es independiente de la mediada por p53 (+1). Material y métodos: se utilizo plasmidos con construcciones Bicistrónicas, mutando a +1 ATG por AAG. Y un control WT p53 AAG

  18. resultado no se encontró cambios significativos de la actividad Fluc, comparada con WT. Ambos genes se traducen de manera independiente

  19. objetivo • Descartar la posibilidad de que la actividad Fluc del ADN bicistrónico p53 (+39) sea debida a la presencia de sitios splice o promotores crípticos

  20. Metodo • Tranfeccion: RNA celulas Hela transfectadas con plasmidos bicistronicos con ensayo con luciferasa Infeccion con virus vaccinia ( con promotor T7) en contrucciones eucarioticas sin promotor • Sincronizacion: Despues de 24 hs , nocodazole G2/ M o Timidina en fase S

  21. Metodo RT-PCR dos primers P1 3’ RLUC P2 3’ FLUC P3 5’ RLUC P4 5’ FLUC Northern blot P-53 (+39 ) P-53 (-1 ) CVB3 IRES Control FLUC ARN

  22. resultado • Observaron presencia de ARN bicistrónico completo y no pequeños ARN • Demostraron que los cistrones eran parte de una transcripción única

  23. Pero hay actividad Fluc posiblemente por pequeñas cantidades de transcriptos monocistrónicos generados por el segundo cistrón , no detectados por estos análisis de ARN

  24. Metodo • Transfección de células Hela con plásmido bicistrónico pBS-Rp53(+39) que carece de promotor eucariota pero tiene promotor T7 • Demuestra la ausencia de promotores crípticos en la secuencia 5’UTR p53 que lleve a la transcripción de ARN Fluc • Infeccion con virus vaccinia ( T7 – ARN polimerasa )

  25. En presencia del virus vaccinia fue alta la actividad de Fluc y Rluc • El control null negativo mostró actividad de Rluc pero es no activo sin este virus • El cociente entre Fluc y Rluc del ARN bicistrónico capeado que contiene 5’UTR de p53 (+39) y (-1) se incrementa comparado con el control de ARN bicistrónico que carece de secuencias de p53

  26. El cociente entre Fluc y Rluc del ARN bicistrónico capeado que contiene 5’UTR de p53 (+39) y (-1) se incrementa comparado con el control de ARN bicistrónico que carece de secuencias de p53

  27. Se investigó la actividad de los IRES que median la traducción de ΔN-p53 y de p53 completa en las diferentes fases del ciclo celular. • Para ello se trasfectaron células HeLa con plásmidos bicistrónicos pRp53(+39)F (regula ΔN-p53) o pRp53(-1)F (regula p53 completa) • Las células fueron detenidas en la transición entre la fase G2 y M con Nocodazole.

  28. REGULACIÓN DE IRES DE P53 DEPENDIENTE DE LA FASE DEL CICLO CELULAR • Se liberó el bloqueo del ciclo celular • Se evaluó la actividad de luciferasa en diferentes tiempos para cada uno de los vectores • Se evaluó el ciclo celular en diferentes tiempos mediante citometría de flujo

  29. RESULTADOS • La actividad de luciferasa de p53(+39)IRES (regula ΔN-p53) fue máxima a las 24 hs. • Coincide con el mayor número de células en fase S (citometría de flujo-24 hs) • Sugiere que la actividad de p53(+39)IRES es máxima durante la progresión a fase S • El nivel de la proteina ΔN-p53 alcanza su punto máximo en fase S

  30. RESULTADOS • La actividad de luciferasa de p53(-1)IRES (regula p53 completa) fue máxima a las 0 hs y a las 42 hs • Coincide con el mayor número de células en la transición entre G2 y M (citometría de flujo-0 hs y 42 hs) • Sugiere que la actividad de p53(-1)IRES es máxima durante la transición entre G2 y M

  31. El experimento se repitió bloqueando el ciclo celular en G1 mediante tratamiento con doble timidina, con resultados semejantes

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