蛋白质定位的方法

1. 蛋白质定位的方法

2. 本节课的主要内容 • 蛋白质定位 • 绿色荧光蛋白 • 绿色荧光蛋白融合蛋白的构建 • 绿色荧光蛋白融合蛋白的检测 • 其它荧光蛋白简介

3. 蛋白质定位 • 真核细胞具有复杂的亚细胞结构。每种细胞器都有一组特定的蛋白。 • 真核细胞除叶绿体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大部分蛋白是在胞浆或糙面内质网合成，最终运至不同地点，形成成熟的蛋白质并行使功能。 • 译产物中很大一部分是以前体蛋白形式存在，往往有蛋白分子定位信号，可引导蛋白质在胞内定位。 • 蛋白质在细胞内的定位问题，是细胞生物学研究的中心问题，也是分子生物学研究的热门话题。理解某些蛋白质的定位从而分析探索其生物学功能，意义重大。

4. 蛋白质定位 蛋白质的亚细胞定位常用方法： 蔗糖密度梯度离心；免疫胶体金标记；免疫荧光；与GFP构建融合基因表达融合蛋白；多糖序列分析等。

5. 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP) • 2008年诺贝尔化学奖 • GFP的结构特点 • GFP的发光机理 • GFP的荧光特性 • GFP的优点 • GFP的改进 • GFP的应用

6. 2008年诺贝尔化学奖 日裔美国科学家 下村修 美国科学家 马丁·查尔非 美国华裔科学家 钱永健 诺贝尔奖委员会将化学奖授予美籍日裔科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健三人，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术。

7. 2008年诺贝尔化学奖 • 下村修：于1962年在水母Aequorea victoria发现并分离得到GFP，并发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿色。 • 马丁·查尔菲：证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域。 • 钱永健：让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，使得同一时刻跟踪多个不同的生物学过程成为现实。

8. GFP的结构特点 一级结构 • GFP由238个氨基酸残基组成 ,分子量为26.9kD • GFP的生色团位于氨基酸序列64~69位 • GFP的第65、66、67位氨基酸分别是丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸，为构成GFP生色团的核心

9. GFP的结构特点 晶体结构 空间结构特点： • 由 11 条β桶状结构(β- barrel) 绕成的一个圆柱体，直径约3nm，长约4nm。 • 一条α螺旋缠绕在圆柱体的轴位置 • 生色团附着在α螺旋上，几乎完美地包埋于圆柱体中心 • 这种方式被称为β罐 (β-can)

10. GFP的发光机理 GFP的生色团是GFP发出荧光的物质基础。 实质：由第65、66、67位的丝氨酸—脱水酪氨酸—甘氨酸形成对羟苯甲基咪唑环酮

11. GFP的荧光特性 • GFP的最大吸收峰为395nm(紫外)，并有一个479nm的副峰(蓝光)；发射光谱最大峰值为509nm(绿光) • 尽管450～490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰，但由于长波能量低，细胞忍受能力强，因此更适合于活体检测。

12. GFP的荧光特性 • GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似，因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察。 • GFP荧光极其稳定，在激发光照射下的抗光漂白能力比荧光素强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。 • GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。

13. GFP的荧光特性 通过对GFP的结构和生化特性进行改造，已获得许多具有不同发射峰和激发峰的突变体，使GFP的荧光强度和作为报告基因的检测灵敏度大大提高。 GFP及其主要突变体的荧光特征 nm

14. GFP的优点 • 易于检测 • 荧光稳定 • 无毒害 • 通用性 • 易于构建载体 • 可进行活细胞定时定位观察 • 易于得到突变体

15. GFP的改进 尽管GFP作为报告基因或分子探针有许多无可比拟的优点，但是野生型GFP（wt GFP）具有一定的缺点： • GFP有两个激发峰影响了其特异性，并且长波激发峰强度较小，不易观察 • GFP合成及折叠产生荧光的过程慢，蛋白质折叠受温度影响大，表达量较低 • GFP在某些植物细胞中并不表达

16. GFP的改进 • 除去GFP基因中隐蔽型内含子 • 消除编码蛋白的积累 • 将GFP定位到特定细胞器中 • 改变碱基组分 • 更换GFP生色团氨基酸 • 插入植物内含子 • 增加增强子和更换强启动子

17. GFP的应用 • 蛋白质定位 • 作为报告基因 • 药物筛选 • 融合抗体 • 生物传感器 • 其他方面

18. GFP融合蛋白的构建 应用亚克隆技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，通过愈伤组织转化法、基因枪、显微注射、电激转化等方法转化到合适的细胞，利用目的基因的基因表达调控机制，如启动子和信号序列来控制融合基因的表达，最终得到融合蛋白，可以研究目的蛋白的定位。 目的基因 融合基因 转化 表达 检测 gfp 基因

19. GFP融合蛋白的构建 最关键的就是：要尽可能的不影响目的蛋白的定位和功能。具体蛋白要具体分析。 将目的基因与gfp基因融合有以下几种方式: • 将gfp置于目的基因后面，即目的基因-gfp • 将gfp置于目的基因前面，即gfp-目的基因。

20. GFP融合蛋白的构建 注意事项： • 两个基因之间用Linker连接。 • 在两个基因交接处可以增加一段核苷酸(3的倍数) ，如增加几个为甘氨酸或赖氨酸等编码的三核苷酸。目的是使得两个基因的蛋白产物的空间结构相互影响较小，有利于GFP发光。 • 前一基因必须要有起始密码，而不能带有终止密码； 后一基因要保证有终止密码。 • 构建了融合基因后，必须测序进行验证，确保融合基因读框正确之后才能进行后续研究，以免浪费人力、 物力和宝贵的时间。

21. GFP融合蛋白的检测 • 定性检测：可以用常规的落射荧光显微镜或者共聚焦显微镜观察； 定量检测：免疫印迹法 酶联免疫吸附法 • 可以在活细胞中进行图像分析，也可以检测固定细胞中的GFP。

22. GFP融合蛋白的检测 注意事项： • 以gfp作为报告基因研究蛋白亚细胞定位，必须做对照。由于某些细胞本身也有自发荧光，必须识别自发荧光与GFP的绿色荧光，以免假象干扰实验，避免得出错误结论。 • 并不是所有的构建正确的融合基因都能正常表达，因此要尽可能多的获得转基因细胞，如果数目较少，可能会检测不到荧光。

23. 其它荧光蛋白简介 根据发射光谱， 荧光蛋白有以下类型，几乎跨越整个可见光谱。 • BFPs 440–470 nm • CFPs 471–500 nm • GFPs 501–520 nm • YFPs 521–550 nm • OFPs 551–575 nm • RFPs 576–610 nm • FRFPs 611–660 nm

24. 参考文献 [1]崔志芳,邹玉红,季爱云. 绿色荧光蛋白研究三个里程碑—2008年诺贝尔化学奖简[J]. Chinese Joural of Nature,2008,30(6):324—328. [2]徐飞虎,龚兴国. 绿色荧光蛋白应用研究进展[J]. 细胞生物学杂志, 2002, 24(6):332—334. [3]岳莉莉,齐义鹏. 绿色荧光蛋白—现代细胞生物学与分子生物学研究领域的新标记物[J].生物工程进展, 1997, 17(4):40—45 [4]张敬之,郭歆冰,谢书阳等. 用慢病毒载体介导产生绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠[J].自然科学,2006,16(5):571—577 [5] Elena Popova,Brit Rentzsch,Michael Bader.Generation and characterization of a GFP transgenic rat line for embryological research[J]. 2008,17:955–963 [6]夏玉凤. 以gfp为报告基因研究蛋白亚细胞定位[J]. 生物技术通报,2006,2:11-13 [7]胡建广,尹艳. GFP与微管结合蛋白和肌动蛋白结合区融合蛋白载体构建与表达[J]. 2004,24(1):53-56

25. That’s all! Thank you!