Patologia Molecolare

1. Patologia Molecolare

2. Patologia molecolare Cerca di spiegare perché un dato cambiamento genetico dia luogo ad un particolare fenotipo clinico

3. Patologia molecolare • Si occupa di: • capire l’effetto di una particolare mutazione sulla QUANTITA’ o FUNZIONALITA’ del prodotto di un dato gene mutato • spiegare perché il cambiamento sia o non sia patogeno

4. Principali classi di mutazioni • DELEZIONI da 1 nt a più megabasi • INSERZIONI • MUTAZIONI DINAMICHE (unità ripetute in tandem che cambiano dimensione quando trasmesse alla prole) • SLITTAMENTI DEL MODULO DI LETTURA • SOSTITUZIONI DI SINGOLE BASI: • MUTAZIONI SINONIME (SILENTI) • MUTAZIONI DI SENSO ERRATO: nel prodotto genico sostituzioni di un aa con un altro • MUTAZIONI NONSENSE: sostituiscono codone di un aa con codone di stop • MUTAZIONE NEI SITI DI SPLICING

5. MUTAZIONI SINONIME (SILENTI), non modificano la sequenza del prodotto genico In genere sono nella terza base del codone , ma talvolta anche nel nucleotide in prima posizione (CUA>-<UUA, AGA>-<CGA) MUTAZIONI NON SINONIME, sequenza alterata in un polipeptide o in un RNA funzionale

6. MUTAZIONI “MISSENSE”: Danno origine ad un codone che specifica un aminoacido diverso da quello originario Sostituzioni conservative:sostituzione di un aminoacido con un altro chimicamente simile Spesso effetto minimo sulla proteina Es: Asp (GAC, GAT) Glu (GAA, GAG) Sostituzioni non conservative:sostituzione di un aminoacidocon uno che ha una catena laterale completamente diversa.

7. MUTAZIONI “NONSENSE” sostituzione di un codone che da luogo ad un codone di terminazione

8. MUTAZIONI NEI SITI DI SPLICING: Creano o distruggono segnali di splicing tra esoni e introni. Si verificano generalmente nei dinucleotidi essenzialmente invarianti GT e AG, localizzati all’inizio di un introne (sito donatore di splicing) o alla sua fine (sito accettore di splicing)

9. Nomenclatura • Specificando i cambiamenti di sequenza: • sostituzioni di aa • sostituzioni di nucleotidi • delezioni ed inserzioni • In base agli effetti: • ALLELE NULLO o AMORFO: non produce nulla • IPOMORFO: non produce nulla • IPERMORFO: produce q.tà maggiori di prodotto o prodotto con attività aumentata • NEOMORFO: produce prodotto o attività nuovi • ANTIMORFO: allele il cui prodotto ha attività antagonista rispetto al prodotto normale

10. Amorfo o Ipomorfo • Delezione • intero gene • parte del gene • Distruzione della struttura genica • inserzione, inversione, traslocazione • Inattivazione del promotore • Destabilizzazione dell’mRNA • Mutazioni di splicing • inattivazione del donatore/accettore • attivazione di criptici siti di splicing

11. GT AG GT AG SPLICING mRNA MUTAZIONI CHE ALTERANO LO SPLICING Se la mutazione colpisce una sequenza consenso dello splicing, il processo di eliminazione degli introni non può avvenire normalmente

12. Amorfo o Ipomorfo • frame-shift nella translazione • inserzione di n+1 o n+2 basi all’interno della sequenza codificante • delezione di n+1 or n+2 basi all’interno della sequenza codificante • mutazioni nonsense • mutazioni missense /delezioni aminoacidiessenziali/conservati • difetti nel processo post-trascrizionale • difetti nella localizzazione cellulare

13. Ipermorfo • trisomia • duplicazione • amplificazione (tumori) • derepressione cromatinica (FSH) • trasposizione sotto un promotore “più forte” • leucemia • “overattività” di una proteina anomala

14. Neomorfo • formazione di proteine chimeriche • duplicazioni • amplificazioni (cancer) • mutazioni missense • inclusione di esoni criptici codificanti • uso di ORFs alternativi • maggiore attività di una proteina anomala

15. MUTAZIONECAMBIAMENTO FENOTIPICO La mutazione di un gene potrebbe causare un cambiamento fenotipico in due modi: • Il prodotto potrebbe essere ridotto o non avere funzione (mutazioniloss of function - amorfo o ipomorfo); • Il prodotto potrebbe agire positivamente in modo anomalo (mutazionigain of function - ipermorfo o neomorfo)

16. Loss of function mutation

17. Loss of function mutation • Most often produce recessive phenotypes • For most gene products the precise quantity is not crucial, and we can get by on half the normal amount • Most inborn errors of metabolism are recessive • For some gene products 50% of the normal level is not sufficient for normal function, and haploinsufficiency produces an abnormal phenotype, which is therefore inherited in a dominant manner • Sometimes a nonfunctional mutant polypeptide interferes with the function of the normal allele in a heterozygous person, giving a dominant negative effect (an antimorph)

18. Loss of function mutations Avvengono quando mutazioni puntiformi in un gene producono gli stessi cambiamenti patologici di un adelezione

19. Mutationi loss of function nel gene PAX3 (Waardenburg s.)

20. Ciuffo di capelli bianchi o capelli brizzolati in età precoce, intorno ai 12 anni. SINDROME DI WAARDENBURG • SORDITÀ neurosensoriale (o deficit uditivo di vario livello) bilaterale • ALTERAZIONInella pigmentazione, sia dei capelli (albinismo parziale, in genere piebaldismo) che della pelle, • ANOMALIE nello sviluppo dei tessuti derivati dalla cresta neurale • LATERALIZZAZIONE del canto mediale Aumentato spazio tra gli angoli interni degli occhi (telecanto). Sopracciglia unite Attaccatura dei capelli frontale molto bassa Una delle caratteristiche più comuni è il diverso colore degli occhi (eterocromia), di solito uno marrone e l'altro blu. Il suo nome deriva da Peter Johannes Waardenburg, un oculista tedesco che per primo notò sintomi di ipoacusia in persone con occhi di colore differente. 4 tipi di WS associazione con altre anomalie WS I WS II non è presente telecanto WS III sono presenti malformazioni agli arti WS IV è presente megacolon (malattia di Hirschsprung)

21. Sindrome Gene Ereditarietà WS I PAX3 (fattore di trascrizione) AD 2q35 WS II MITF (fattore di trascrizione) AD 3p14.1-p12.3 WS III PAX3 (fattore di trascrizione) AD 2q35 WS IV EDNRB (recettore endotelina) AR 13q22 EDN3 (endotelina) AR 20q13.2-q13.3 SOX10 (fattore di trascrizione) AD 22q13

22. Mutationi in PAX3(locus cromosomico 2q35) causa WSI and WSIII Mutazioni causative in PAX3 includono sostituzioniaminoacidiche, frameshifts,mutazioni displicing, and in alcuni pazienti delezioni complete della sequenza PAX3. Tutte producono lo stesso risultato clinico: la perdita di funzione di PAX3

23. Modi di ridurre o abolire la funzione di un prodotto genico

24. Ci sono differenti modi di ridurre o abolire la funzione di un prodotto genico(emoglobinopatiesono un esempio di molti di questi meccanismi) I sintomi clinici derivano direttamente dal mal funzionamento della proteina, che a 15 g per 100 ml di sangue è facile da studiare e quindi la relazione tra eventi clinici e molecolari è più chiara per queste patologieche per altre malattie

25. EMOGLOBINOPATIE Tre gruppi principali 1. Talassemiascausate da inadeguate quantità di catene α o β Gli alleli sono classificati in quelli che non producono (a0, β0) e quelli che producono meno quantità di proteina (a+, β+)

26. a2 a1 Talassemie normale La perdita di geni a-globinici porta a forme di a-talassemia di differente severità a2-talassemia (portatore silente) a1-talassemia (anemia non significativa) Hb H disease (anemia da lieve a severa) Idrope fetale (morte fetale o in epoca neonatale)

28. Distrofia Muscolare di Duchenne E’ una forma di distrofia muscolare trasmessa come carattere legato all’X che determina degenerazione progressiva delle fibre muscolari E’ dovuta all’assenza di una proteina detta Distrofina L’assenza di questa proteina determina una serie di eventi che portano a degenerazione del tessuto muscolare, che viene sostituito da tessuto fibroso e adiposo. Conseguenza clinica: progressiva perdita di forza muscolare con conseguente progressiva perdita delle abilità motorie Deletions in the dystrophin (DMD) gene

29. Deletions in the dystrophin (DMD) gene size of the deletion Frameshifdeletions produce the lethal Duchenne muscular dystrophy, in whichno dystrophin is produced Nonframeshif mutations cause the milder Becker form, in which dystrophin is present but abnormal

30. MUTAZIONI CHE CAMBIANO LA FASE DI LETTURA (FRAMESHIFT) • Qualunque inserzione o delezione di un numero di basi che non sia multiplo di 3 in un esone comporta necessariamente una modifica della fase di lettura. Tale situazione esita, prima o poi, nella comparsa di un codone nonsenso prematuro. • Se l’alterazione ha luogo all’estremità 3’ della sequenza codificante, questa può anche essere allungata fino ad un codone nonsenso neoformato nella regione 3’ non codificante del messaggero.

31. GT AG GT AG SPLICING mRNA MUTAZIONI CHE ALTERANO LO SPLICING Se la mutazione colpisce una sequenza consenso dello splicing, il processo di eliminazione degli introni non può avvenire normalmente

32. SD SA In generale, l’esone localizzato a monte di un sito donatore mutato, o a valle di un sito accettore mutato, viene eliminato.

33. RITENZIONE DI UN INTRONE SD SA

34. SD SA ATTIVAZIONE DI UN SITO CRIPTICO DI SPLICING SPLICE DONOR CRIPTICO CT GT AG

35. Loss of function mutation • Most often produce recessive phenotypes • For most gene products the precise quantity is not crucial, and we can get by on half the normal amount • Most inborn errors of metabolism are recessive • For some gene products 50% of the normal level is not sufficient for normal function, and haploinsufficiency produces an abnormal phenotype, which is therefore inherited in a dominant manner • Sometimes a nonfunctional mutant polypeptide interferes with the function of the normal allele in a heterozygous person, giving a dominant negative effect (an antimorph)

36. Only relatively few genes show haploinsufficiency

37. Why relatively few genes are dosage-sensitive? Sometimes, if the gene product is needed in large quantities, the total synthetic capacity of the cell, even at maximum transcription levels, may be insufficient if only one copy of the gene is present Example: elastin In people heterozygous for a deletion or loss of function mutation of elastin, for the most part the elastic tissues (skin, lung, blood vessels) work normally, but often the aorta, a highly elastic tissue, shows some degree of narrowing just above the heart (supravalvular aortic stenosis), which may require surgery

38. Loss of function mutation • Most often produce recessive phenotypes • For most gene products the precise quantity is not crucial, and we can get by on half the normal amount • Most inborn errors of metabolism are recessive • For some gene products 50% of the normal level is not sufficient for normal function, and haploinsufficiency produces an abnormal phenotype, which is therefore inherited in a dominant manner • Sometimes a nonfunctional mutant polypeptide interferes with the function of the normal allele in a heterozygous person, giving a dominant negative effect (an antimorph)

39. Mutations in proteins that work as dimers or multimers sometimes produce dominant negative effects A dominant negative effect occurs when a mutant polypeptide not only loses its own function, but also interferes with the product of the normal allele in a heterozygote Dominant negative mutations cause more severe effects than deletion or nonsense mutations in the same gene. Structural proteins that contribute to multimeric structures are vulnerable to dominant negative effects Example: Collagens

40. Fibrillar collagens, the major structural proteins of connective tissue, are built of triple helices of polypeptide chains, sometimes homotrimers, sometimes heterotrimers, that are assembled into close-packed crosslinked arrays to form rigid fibrils

41. Y Y In newly synthesized polypeptide chains (preprocollagen), N- and C-terminal propeptides flank a regular repeating sequence (Gly- X-Y)n, where X is usually proline (13%) and Y hydroxyproline, and the other is any amino acid

42. Three preprocollagen chains associate and wind into a triple helix under control of the C-terminal propeptide. After formation of the triple helix, the N- and C-terminal propeptides are cleaved off

43. Collagen types I, II and III are the classical fibril-forming collagens and account for 80-90% of all collagens in the human body. Type V and XI collagens are also classified as fibrillar collagens on the basis of their homology with type I-III collagens

44. A polypeptide that complexes with normal chains, but then wrecks the triple helix can reduce the yield of functional collagen to well below 50%

45. Mutations in these genes usually produce osteogenesis imperfecta (OI)

46. Mutations in these genes usually produce osteogenesis imperfecta (OI) Frameshifts and nonsense mutations produce type 1 OI, the mildest form, while amino acid substitutions in the Gly-X-Y repeated units are seen in the more severe types II, III and IV OI.

47. Mild OI: frameshifts and nonsense mutations Severe OI: amino acid substitutions in the Gly-X-Y repeated

48. osteogenesi imperfetta

49. Skipping of exon 6 (of COL1A1 or COL1A2) has a quite different effect. The site for cleavage of the N-terminal propeptide is lost and abnormal collagen produced causes Ehlers Danlos syndrome Type VII (laxity of skin and joints) A different function has been lost, and a different phenotype results

50. Ehlers-Danlos syndrome