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Genetic Suppression of Polyglutamine Toxicity in Drosophila

Genetic Suppression of Polyglutamine Toxicity in Drosophila. Parsa Kasemi- Esfarjani , et al ; Science 287, 1837 (2000). Visée de l’article. Introduction. Introduction. Chorée de Huntington : Agrégats de polyglutamine au niveau du SNC

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Genetic Suppression of Polyglutamine Toxicity in Drosophila

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Presentation Transcript

  1. Genetic Suppression of Polyglutamine Toxicity in Drosophila Parsa Kasemi-Esfarjani, et al ; Science 287, 1837 (2000)

  2. Visée de l’article Introduction

  3. Introduction • Chorée de Huntington : Agrégats de polyglutamine au niveau du SNC • Utilisation de drosophiles présentant ce phénotype comme modèle de la maladie • Criblage des gènes suppresseurs de ce phénotype • Homologie des protéines entre la drosophile et l’humain

  4. Description et élaboration des lignées transgéniques poly-Gln Description de la méthode

  5. Description et élaboration des lignées transgéniques poly-Gln • Lignées comportant des polyCAG • 20 répétitions : lignée 20Q (normales) • 127 répétitions : lignée 127Q (augmentées) • Après traduction des ARNm, obtention de polyglutamines de ces 2 types • Utilisation de différents promoteurs pour induire l’expression génique spécifiquement dans les yeux

  6. Rappel : Mutagénèse par élément P Pied P w+ Plasmide avec Elément P Source de Transposase Site de clonage AmpiR Pied P Transposase Origine de réplication w- P A Embryon de drosophile

  7. Élaboration préalable de 2 lignées transgéniques

  8. Lignée UAS-polyCAG • Insertion d’un élément P contenant : • Promoteur UAS • Séquence polyCAG (20 ou 127 répétitions) • Séquence codant pour un épitope de l’hémagglutinine (HA) Figure : construction génomique incorporée dans le génome de la drosophile

  9. Lignée GMR-Gal4 • Insertion d’un élément P contenant : • Promoteur GMR (expression au niveau des yeux) • Séquence GAL4 codant pour la protéine GAL4 Figure : Construction génomique incorporée dans le génome de la drosophile

  10. Croisement des 2 lignées • Croisement et 3 lignées 20Q et de 3 lignées 127Q par la GMR-GAL4 (fond génétique) • Obtention de drosophiles exprimant les polyglutamines dans l’œil. • Elles sont UAS-polyCAG et GMR-GAL4

  11. Induction de la transcription Facteur de transcription spécifique de l’œil 5’ 3’ GMR GAL 4 Transcription de GAL4 Protéine Gal4 ARNm Gal4 Traduction de l’ARNm Gal4 Induction de la transcription 5’ 3’ UAS Poly CAG HA Transcription ARNm Poly CAG HA Traduction Polyglutamine avec épitope HA

  12. Elaboration des lignées transgéniques poly-Gln Résultats

  13. Phénotypes obtenus après croisement • Lignées 20Q : [sauvage] • Lignées 127Q : [agrégation de polyglutamines] Utilisation des lignées 127 Q pour trouver les gènes suppresseurs.

  14. Criblage et mise en évidence des gènes suppresseurs Description de la méthode

  15. Création des lignées transgéniques à testée • 7000 éléments P différents (contenant 7000 séquences autosomales différentes) • Mutagénèse utilisant ces éléments P : obtention de 7000 lignées transgéniques différentes. • Croisement avec les lignées 127 Q

  16. Criblage et mise en évidence des gènes suppresseurs Résultats

  17. Lignées intéressantes Sur les 7000 lignées croisées avec les drosophiles présentant la dégénérescence, on trouve : • 29 lignées « Enhancer » • 30 lignées « Suppresseur » • On retient Deux lignées Suppresseurs : EU 3500 et EU 3220

  18. Techniques d’observation

  19. Mise en évidence des différents phénotypes • Aspect extérieur : microscopie optique, et MEB • Immunohistologie et observation microscopique : DAPI et FITC

  20. Microscopie photonique

  21. Microscopie électronique à balayages

  22. FITC (Fluorescein isothiocyanate)

  23. DAPI (Di aminidophénylindol)

  24. Résultats

  25. Lignée EU3500 • Code pour HDJ1 (en 3’ de EU3500) : protéine homologue de la protéine HSP40/HDJ1 chez l’humain • Domaine J en NH2 terminal (jonction)

  26. Lignée EU3220 • Code pour DTPR2 (en 3’ de EU3220) : protéine homologue de la protéine répétée TRP2 humaine (tétratricopeptide 2) • Domaine J en COOH terminal

  27. Discussion

  28. Implication du domaine J • Responsable la suppression • Domaine présent sur les HSP • Etudes complémentaires in vitro : domaine J supprime les agrégations par fixation des protéines agrégées • Ici dHdj1 ou dtpr2 se lieraient donc aux polyglutamines pour les empêcher de former des agrégats

  29. Conclusion

  30. Gènes suppresseurs déterminés • Croisement de mouches présentant un phénotype à supprimer, par des mouches possédant chacune un élément P différent • Détermination des descendants présentant un phénotype supprimé • On peut déterminer quel gène est impliqué dans la suppression du phénotype mutant

  31. Vers un traitement? • Agrégats de polyglutamine = gain de fonction • On ne peut pas insérer un gène pour le traiter : thérapie génique impossible • On pourrait tenter de surexprimer un gène pour supprimer le phénotype. Problème : pléiotropie • Difficile

  32. The end

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