Stanovení glukosy elektrochemicky glukometrem

1. Stanovení glukosy elektrochemicky glukometrem Luděk Dohnal1, Paul Faigl2 1 Referenční laboratoř pro klinickou biochemii MZ ČR, Praha 2 Res. Phys. Chem., formerly University of Southern Queensland, now Wagners CFT, Toowoomba, Qld., Australia 12.10.2009 1

2. Úvod glukóza – z nejdůležitějších a nejčastěji stanovovaných analytů (nejen) v humánní medicině zvýšení: DM a jiné endokrinní poruchy, pankreatitis, nemoci CNS – encefalitis, edém mozku, meningitis, hepatopatie, stresy, po jídle snížení: gravidita a laktace, větší fyzická námaha, ca a jiné nemoci pankreatu, hladovění, DM, abusus kofeinu, nikotinu a alkoholu, hepatopatie – vyčerpání glykogenu, vrozené poruchy metabolismu sacharidů 12.10.2009 2

3. Principy stanovení glukózy stanovení – enzymová oxidace, HK (fotometricky), GOD a GDH (fotometricky i elektrochemicky) glukóza + ATP-HK → glukóza-6-P + ADP glukóza-6-P + NAD+-G-6-P-DH → 6-P-glukonát + NADH + H+ zvýšení absorbance při 340 nm způsobené NADH je úměrné koncentraci glukózy 12.10.2009 3

4. Principy stanovení glukózy glukóza + FAD-GOD → glukonolakton + FADH2-GODFADH2-GOD + O2 → FAD-GOD + H2O2 vzniklý H2O2 měřen fotometricky oxidativní kopulací chromogenu(ů) za vzniku chromoforu za katalýzy POD nebo elektrochemicky glukóza + oxidovaný_koenzym-GDH→ glukonolakton + reduk_koenzym-GDH kofaktorem je PQQ = pyrrolchinolin-chinon, FAD nebo NAD, jejichž redukované formy kyslík neoxiduje 12.10.2009 4

5. Principy měření glukometry do 1987 výhradně fotometricky resp. reflektometricky dnes téměř výhradně elektrochemicky, ampérometrie, málo coulom(b)metrie, chronoampérometrie pouze výzkumně u GOD měření peroxidu vodíku jeho elektrochemickou oxidací H2O2 → 2H++ O2 + 2e- u GDH měření redukovného koenzymu jeho elektrochemickou oxidací, často redoxní “mediátor” - např. fenatrolin/chinon, ferrokyanid/ferrikyanid 12.10.2009 5

6. Interference při měřeních glukometry dnes nejčastěji používány GOD a GDH-PQQ GOD - vyšší koncentrace O2falešně sníží glukózu GDH-PQQ – reagují i jiné sacharidy maltóza, galaktóza, icodextrin = polymer maltózy, xylóza (intravenózní výživa, peritoneální dialýza) všeobecně interferuje askorbát interference léků? 12.10.2009 6

7. Robustnost měření glukometry teplotní závislost – větší u ampérometrie než u coulometrie, kvalitní teplotní kompenzace vliv objemu vzorku větší u coulometrie než u ampérometrie vysoký hematokrit falešně snižuje, nízký falešně zvyšuje (typicky pro HCT 0,35 je obsah vody 0,85 kg/l, pro HCT 0,55 je obsah vody 0,81 kg/l) komplikovaná problematika skutečně měřené veličiny, sérum vs. krev, molarita vs. molalita, aktivita vs. koncentrace apod. (1) 12.10.2009 7

8. Měřící proužky • plastovápodložka, alespoňdvěelektrody, komůrka o malémobjemu, zakotvený/é enzym(y), mediátor(y) a pomocnélátky – stabilisátoryenzymu, detergenty (3) • pracovníelektroda - typickysítotiskinkoustu z uhlíkovýchčástic a polyesterovéhopojivanebovakuovénapaření Au resp. Pd (3) • referenčníelektroda – Ag/AgClneboinertnívodič (zpravidla z inertníhokovujakopracovníelektroda) (3) 12.10.2009 8

9. Vzorek, doba měření • odběrkapilárníkrve – vpichlancetou do bříškaprstu • typickýobjemřádovějednotkyaždesítkymikrolitrů (kapkakrvecca 30 µl) • plněníkomůrkykapilárnímisilami • typickádobaměřenířádovějednotkyaždesítkysekund • nevýhodyvelmimalýchobjemů, časů, tzv. bezbolestnýchodběrů - marketing 12.10.2009 9

10. Přesnost (precision) měření glukometry určenými pro sebekontrolu pacientů • ČSN EN ISO 15197:2003(2) požaduje: • testovatopakovatelnost (repeatability), vevzorcíchkrve, nejlépežilní, pro 5 koncentracíccarovnoměrněrozloženýchuvnitřměřícíhorozsahu, každývzorek 10x na min. 10 glukometrech – min. 500 výsledků • spočítataritmet. průměr, SD a VK pro každoudvojicikonc./glukometr a pro každoukonc. (všechnyglukometry) • minimálnípožadavkynavýsledkynejsoutoutonormouurčeny 12.10.2009 10

11. Přesnost (precision) měření glukometry určenými pro sebekontrolu pacientů • ČSN EN ISO 15197:2003(2) požaduje: • testovatreprodukovatelnost (intermediate precision) v kontrolníchmateriálech (přednostnědodávanýchvýrobcem) pro 3 koncentraceccarovnoměrněrozloženéuvnitřměřícíhorozsahu, 1x nanejméně 10 glukometrech a s víceuživatelipodobu min. 10 dnů – min. 300 výsledků • spočítataritmet. průměr, SD a VK pro každoukonc. (všechnyglukometry) • minimálnípožadavkynavýsledkynejsoutoutonormouurčeny 12.10.2009 11

12. Správnost (accuracy) měření glukometry určenými pro sebekontrolu pacientů ČSN EN ISO 15197:2003(2) požaduje: proměřit nejméně 100 vzorků kapilární krve případně obohacené glukózou či ochuzené o glukózu změřit dvojmo na dvou různých glukometrech dle normou uvedeného schematu – min. 400 výsledků minimální požadavky na výsledky– pro konc. < 4,2 mmol/l musí 95% výsledků být v mezích ±0,83 mmol/l a pro konc. ≥4,2 mmol/l v mezích ±20% 12.10.2009 12

13. Závěrem posledních 15 let značný pokrok problémy s preanalytikou (“bezbolestné odběry”), marketinkem (“měřící rozsah”) otázka, zda méně by nebylo více – velmi malé objemy a časy problémy s odborným dohledem nad přístroji i výsledky, možné interference často pouze semikvantitativní určení glukózy 12.10.2009 13

14. Literatura 1) Dohnal L., Štern P.: Stanovení glukózy glukometrem - mýty a skutečnost. Fons No.4, 36-38 (2008), plný text dostupný na http://www1.lf1.cuni.cz/~ldohna/dohnal/gluk_myty_skut.htm (12.10.2009) 2) ČSN EN ISO 15197:2003 Systémy diagnostických zkoušek in vitro – Požadavky na systémy monitorování glykémie pro sebekontrolu pacientů s diabetes mellitus 3) Kajabová M., Štern P.: ústnísdělení 12.10.2009 14