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Elettroforesi

Elettroforesi. Separazione differenziata di molecole cariche (aminoacidi, peptidi, proteine, Acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elelttrico. Principio:. Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico. Tecnica sia ANALITICA che PREPARATIVA .

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Presentation Transcript


  1. Elettroforesi Separazione differenziata di molecole cariche (aminoacidi, peptidi, proteine, Acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elelttrico

  2. Principio: • Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico. • Tecnica sia ANALITICA che PREPARATIVA. • Forza elettrica : Fel = q · E • Forza frizionale : Ffr = f ·v (f = 6 r ) • Quando le forze si bilanciano: • q ·E = f ·v • q •  v = — · E • f • v q • mobilità elettroforetica : = — = — • E f

  3. Applicando un campo elettrico si può avere effetto Joule: V = R I W = R I2 • Operare a I costante • Dissipare l’eccesso di calore

  4. Acidi nucleici

  5. ELETTROFORESI SU SUPPORTO su carta su gel

  6. Gel di agarosio – Elettroforesi orizzontale

  7. Formazione di un gel di poliacrilammide CH2

  8. Acrilamide, bisacrilamide  monomeri • Ione perossodisolfato  iniziatore • TEMED  catalizzatore • L’ossigeno è un radicale, quindi interferisce con la polimerizzazione

  9. La mobilità elettrofoertica risulta inferiore a quella che ci si aspettera • Effetto setaccio del supporto di separazione • Grafico di Ferguson: • Mobilità elettroforetica in funzione della concentrazione del gel

  10. Effetto “setaccio” in un gel uniforme

  11. MOBILITA’ ELETTROFORETICA ED EFFETTO “SETACCIO MOLECOLARE” Se q  L,  in assenza di gel e’ pressoché indipendente dalle dimensioni molecolari

  12. Migrazione di proteine e DNA in gel di varia porosita’

  13. Visualizzazione del DNA: etidio bromuro luce UV

  14. Poiché il DNA sottoposto ad un campo elettrico migra ad una velocità proporzionale all’inverso del log10 del peso molecolare, facendo migrare il campione in esame insieme ad uno standard di pesi molecolari di dimensione nota è possibile estrapolare il peso molecolare del campione ignoto pozzetti 1 2 3 4 5 6 7 8 -20 -10 -7.0 x distanza in cm dai pozzetti

  15. Log kb X=log10 0,54 100,54= Kb 3,46 1.30 1.00 0.80 0.69 0.60 0.47 0.30 0.20 0.00 -0.15 -0.3 X 0 1 2 3 4 5 6 Distanza in cm dal pozzetto Utilizzando una serie di frammenti di DNA a peso molecolare noto è possibile costruire una curva di taratura. Ogni banda corrisponde ad un punto le cui coordinate sono costituite, in ascissa, dalla distanza in cm dal pozzetto e, in ordinata, dal Log10 del peso molecolare. Congiungendo tutti i punti, riportati su un grafico semi-logarittimico, si dovrebbe formare una linea approssimativamente retta, da cui, nota la distanza dal pozzetto percorsa da una banda incognita, è possibile estrapolare il peso molecolare approssimativo kb 20 10 7 5 4 3 2 1,6 1 0.7 0,5

  16. SDS-PAGE (Sodium DodecylSulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis) Permette la separazione delle proteine solo in base al peso molecolare

  17. SDS-PAGE : elettroforesi discontinua Le tre specie ioniche aggiustano la loro concentrazione in modo che [Cl –] > [proteina-SDS] > [glicinato]. Poiché la quantità di proteina-SDS e’ molto piccola, questa specie si concentra in una banda molto stretta fra la banda del glicinato e quella del Cl –.

  18. Colorazione con Coomassie Colorazione con nitrato di Ag Si possono effettuare valutazioni quantitative delle bande proteiche col densitometro: misurazione della luce trasmessa quando un raggio luminoso è fatto passare attraverso il gel colorato. Si hanno picchi di assorbimento di cui si può calcolare l’area che è proporzionale alla quantità di proteina

  19. Applicazioni della SDS-PAGE • Purezza del campione • Determinazione del PM • Western blot • Purificazione della proteina

  20. Applicazioni dell’SDS-PAGE Determinazione del PM

  21. Western blotting

  22. Elettroforesi delle proteine plasmatiche

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