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遗传学实验. S201 & S203. 黎双飞 13926597017 667017 26535432 sfli@szu.edu.cn. 细胞遗传学实验(染色体实验 5 次) 经典遗传学 ( 果蝇为材料 4 次) 基础分子遗传学实验( DNA 提取 2 次) 数量形状遗传学实验( 1 次). 实验一 实验操作基本技能讲解和种子萌发. 一 实验目的 1 了解实验室常规仪器使用和操作注意事项; 2 掌握常见植物种子萌发方法 ; 3 掌握种子有丝分裂根尖取材及处理过程。. 二 实验内容 (一) 实验室安全和注意事项;
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遗传学实验 S201 & S203 黎双飞 13926597017 667017 26535432 sfli@szu.edu.cn
细胞遗传学实验(染色体实验5次)经典遗传学(果蝇为材料 4次)基础分子遗传学实验(DNA提取 2次)数量形状遗传学实验(1次)
实验一 实验操作基本技能讲解和种子萌发 一 实验目的 1 了解实验室常规仪器使用和操作注意事项; 2 掌握常见植物种子萌发方法 ; 3 掌握种子有丝分裂根尖取材及处理过程。
二 实验内容 (一) 实验室安全和注意事项; (二)熟悉显微镜、离心机和移液器的使用; (三)熟悉常用染料、缓冲液的配制; (四)实验报告格式 (五)种子萌发,处理根尖;
双目观察筒,镜筒倾角为30°,瞳间距48-75mm 1 CX21显微镜
显微镜的使用: 1. 将所需观察的标本放在载物台,上卡夹住。 2. 将标本移动到载物台中间,先用低倍物镜观察。 3. 将显微镜亮度调节钮调至最小,接通显微镜电源,打开显微镜电源开关。 4. 把亮度调节钮移至适当位置,转动粗调手轮将载物台,上升到能见到标本的影形,转动微调手轮即可得到清晰的物象。 5. 使用完毕转动粗调手轮将工作台下降到底,再将亮度调节钮移到最小亮度处。 6. 关闭电源开关。 注意事项: 1. 打开显微镜电源开关前一定要将亮度调节钮调至最小 2. 先用低倍物镜观察,再换高倍物镜,如果使用油镜观察,注意镜头的转动方向和使用后用清洁剂去除干净香柏油。 3. 转换物镜时,手握转换器,而不是物镜。
离心机: • 操作程序: • 把离心机放置于平面桌或平面台上,检查离心机是否放置平稳。 • 打开门盖,将离心管平衡后放入转子体内,离心管必须对称放入。 • 关上门盖,检查门盖是否关紧。 • 插上电源插座,按下电源开关。 • 设置转速和时间:时间为倒计时,转速为由低到高且不能超过规定转速。 • 当转子停转后,打开门盖取出离心管。 • 关断电源开关,离心机断电。 • 注意事项: • 离心管必须平衡,且不能超过规定容量;如果是小体积的1.5 ml EP管,则必须是加入相同体积的液体; • 离心管必须对称放入; • 门盖一定要关紧; • 设置转速时要由低到高。
电子电平使用注意事项 1 了解安装条件、安装步骤、电源条件; 2 熟悉具体使用 首先要清洁天平;接着平衡;然后称量;最后清洁、复原。 注意: 工作台水平干净;不能超出陈量范围;药品轻放、慢放;剧毒或腐蚀药品注意防护。
移液枪的使用 移液枪的操作方法 • 设置移液体积:手柄的显示窗清楚地显示移液器所移液量。移液量通过顺时针或逆时针旋转操作按钮来设置。 • 装配吸头:在装配吸头前要保证移液嘴连件的清洁。将吸头紧紧按在移液器吸液嘴连件上,确保密封完好,其标志是在吸头与黑色吸液嘴连件形成清晰的密封圈。 • 吸液和放液:吸液时移液器保持竖直,吸头尖端没入液面下3毫米以下进行吸液。放液时吸头尖端可靠在容器内壁。慢吸慢放,始终用拇指控制按钮运动,以保证连贯一致。 • 丢弃吸头:移液后,用力向下按动推出器推出吸头,将吸头丢弃到废物缸中。 • 放置好移液器:移液枪用完之后要归到最大计量的位置,并放置在移液器架之上。
移液枪的使用 注意事项: (1)吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指,绝不允许突然松开,以防将溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气。 (2)为获得较高的精度,吸头需预先吸取一次样品溶液,然后再正式移液,因为吸取血清蛋白质溶液或有机溶剂时,吸头内壁会残留一层”液膜”,造成排液量偏小而产生误差。 (3)浓度和粘度大的液体,会产生误差,为消除其误差的补偿量,可由试验确定,补偿量可用调节旋钮改变读数窗的读数来进行设定。 (4)可用分析天平称量所取纯水的重量并进行计算的方法,来校正取液器,1mL 蒸馏水20℃时重0.9982g.
移液枪的使用 (5)移液器反复撞击吸头来上紧的方法是非常不可取的,长期操作会使内部零件松散而损坏移液器。(6)移液器未装吸头时,切莫移液。 (7)在设置量程时,请注意旋转到所需量程数字清清楚楚在显示窗中,所设量程在移液器量程范围内不要将按钮旋出量程,否则会卡住机械装置,损坏了移液器。(8)移液器严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性的液体(如浓酸、浓碱、有机物等)。 (9)严禁使用移液器吹打混匀液体。(10)不要用大量程的移液器移取小体积的液体,以免影响准确度。同时,如果需要移取量程范围以外较大量的液体,请使用移液管进行操作。
(三) 常用染色液或稀释溶剂的配置 (每天来前10的同学免费提供纸质材料) 1) 常用固定液 纯酒精(或甲醇)可固定细胞质中的蛋白质,穿透组织的速度快,但易引起组织变硬和收缩。而醋酸(又名乙酸,由于在16.7℃以下的温度即凝固成冰状固体,故又名冰醋酸。)可固定染色质,又可使细胞膨胀,所以与酒精(或甲醇)混合使用时,它们的作用可以互补。 常用配方: 纯酒精(或甲醇) 3份 或 纯酒精(或甲醇) 2份 冰醋酸 1份 冰醋酸 1份
(三) 常用染色液或稀释溶剂的配置 1) 常用染液 1 铁醋酸洋红 45%的醋酸100毫升,加入1-2克洋红(carmine)煮沸,冷却后过滤。然后加入1-2%铁明矾水溶液5-10滴。或者可放入1个小铁钉,1分钟后取出。加入铁质有利于染色,但铁质过量,则会产生沉淀。此液可长期保存备用。常用于植物细胞染色,对花粉母细胞效果更佳。 2 苯酚(石炭酸)品红 苯酚品红(carbol fuchsin) 母液A 3克碱性品红,溶于100毫升70%酒精中(可长期保存)。 母液B 母液A10毫升,加入90毫升5%苯酚水溶液。 取45 毫升母液B,加入6毫升冰醋酸和6毫升37%福尔马林溶液,即为苯酚品红染液。 改良苯酚品红 2-10毫升苯酚品红染液,加入98-90毫升45%冰醋酸和1-1.8山梨醇(山梨醇过量会出现结晶,影响制片的效果)。 此染液若放置两周,会提高染色效果。
二 常用染色液或稀释溶剂的配置 (二) 常用染液 3 吉母萨(Giemsa)染液 0.5 g吉母萨,加几滴甘油进行研磨。研好后,加入33毫升甘油,放56-60℃条件下1.5-2小时,促使其溶化。再加入33毫升甲醇,热过滤,保存在棕色瓶中备用。此为原液。染色时,一般以PH=6.4-7.2的磷酸缓冲液按要求比例稀释使用。 4 0.1%秋水仙碱溶液 秋水仙碱0.1克(先用95%的酒精约5-10 ml助溶),蒸馏水100毫升,待完全溶解后将棕色瓶再用黑纸包装起来,4℃冰箱保存备用。
(四) 实验报告格式 • 每次实验报告均要有封面; • 报告纸A4纸; • 实验目的 • 实验材料 • 实验简要步骤 • 实验结果 • 讨论分析
(五) 种子萌发和有丝分裂根尖准备 1 实验种子p 黄豆、蚕豆、红豆、绿豆 2 用具 培养皿,纱布,剪刀或刀片,冻存管 3 药品 秋水仙素, 冰醋酸、无水乙醇, 卡诺氏固定液(无水乙醇:冰醋酸=3:1)
(五) 种子萌发和有丝分裂根尖准备 4 种子萌发过程 1)挑选适量黄豆种子放在已铺好纱布的培养皿中,加适量蒸馏水浸泡种子(水浸没种子的2/3); 2)培养皿浸泡种子约(48-)120小时,观察种子萌发情况; 3)每天更换水,切0.5-1cm根尖用0.1%秋水仙素处理4h以上,然后用卡诺氏固定液固定24h,固定时间4-24小时; 4)根尖用70%乙醇保存(冻存管)。
萌发过程 种子从吸胀开始的一系列有序的生理过程和形态发生过程,大致可分 5个阶段: ①吸胀。为物理过程。种子浸于水中或落到潮湿的土壤中,其内的亲水性物质便吸引水分子,使种子体积迅速增大(有时可增大 1倍以上)。吸胀开始时吸水较快,以后逐渐减慢。吸胀的结果使种皮变软或破裂,种皮对气体等的通透性增加,萌发开始。②水合与酶的活化。这个阶段吸胀基本结束,种子细胞的细胞壁和原生质发生水合,原生质从凝胶状态转变为溶胶状态。各种酶开始活化,呼吸和代谢作用急剧增强。如大麦种子吸胀后,胚首先释放赤霉素并转移至糊粉层,在此诱导水解酶(如 α-淀粉酶、蛋白酶等)的合成。水解酶将胚乳中贮存的淀粉、蛋白质水解成可溶性物质(麦芽糖、葡萄糖、氨基酸等),并陆续转运到胚轴供胚生长的需要,由此而启动了一系列复杂的幼苗形态发生过程。 ③细胞分裂和增大。这时吸水量又迅速增加,胚开始生长,种子内贮存的营养物质开始大量消耗。 ④胚突破种皮。胚生长后体积增大,突破种皮而外露。大多数种子先出胚根,接着长出胚芽。 ⑤长成幼苗。以后长出根、茎、叶,形成幼苗。有的种子的下胚轴不伸长,子叶留在土中,只由上胚轴和胚芽长出土面生成幼苗,这类幼苗称为子叶留土幼苗,如豌豆、蚕豆等。有些植物如棉花、油菜、瓜类、菜豆等的种子萌发时下胚轴伸长,把子叶顶出土面,形成子叶出土幼苗。
种子萌发的外界条件 种子萌发要求有适宜的水分、温度和氧供应。有些植物的种子萌发还受光照有无的调节。 水 休眠的种子含水量一般只占干重的10%左右。种子必须吸收足够的水分才能启动一系列酶的活动,开始萌发。不同种子萌发时吸水量不同。含蛋白质较多的种子如豆科的大豆、花生等吸水较多;而禾谷类种子如小麦、水稻等以含淀粉为主,吸水较少。一般种子吸水有一个临界值,在此以下不能萌发。例如大豆萌发时要求最低吸水量为风干重的120%,而小麦则为60%,水稻为35~40%。 温度 各类种子的萌发一般都有最低、最适和最高3个基点温度。温带植物种子萌发,要求的温度范围比热带的低。如温带起源植物小麦萌发的 3个基点温度分别为:0~5℃,25~31℃,31~37℃;而热带起源的植物水稻的 3基点则分别为10~13℃,25~35℃,38~40℃。还有许多植物种子在昼夜变动的温度下比在恒温条件下更易于萌发。例如小糠草种子在 21℃下萌发率为53%,在28℃下也只有72%,但在昼夜温度交替变动于28℃和21℃之间的情况下发芽率可达95%。种子萌发所要求的温度还常因其他环境条件(如水分)不同而有差异,幼根和幼芽生长的最适温度也不相同。
种子萌发的外界条件: 氧 种子吸水后呼吸作用增强,需氧量加大。一般作物种子要求其周围空气中含氧量在10%以上才能正常萌发。脂肪种子也叫含油种子,如大豆、花生等的种子萌发时需氧更多。空气含氧量在 5%以下时大多数种子不能萌发。土壤水分过多或土面板结使土壤空隙减少,通气不良,均会降低土壤空气的氧含量,影响种子萌发。 光 有少数植物如黄榕、烟草和莴苣的种子在无光条件下不能萌发。这类种子叫需光种子。有些植物如早熟禾、月见草属的Oenothera bienusis和毛蕊花等的种子在有光条件下萌发得好些。还有一些百合科植物和洋葱、番茄、曼陀罗的种子萌发则为光所抑制,这类种子称为嫌光种子。需光种子一般很小,贮藏物很少,只有在土面有光条件下萌发,才能保证幼苗很快出土行光合作用,不致因养料耗尽而死亡。嫌光种子则相反,因为不能在土表有光处萌发,避免了幼苗因表土水分不足而干死。此外还有些植物如莴苣的种子萌发有光周期现象(见光敏素)。 研究意义 了解作物种子萌发所需的条件,掌握土壤湿度和播种深度,对于播种后早出苗、出全苗极为重要,是获得高产的第一步。有些作物如早稻的某些品种,种子没有休眠期,收获时如遇雨水和高温,就会在农田或打谷场上的植株上萌发,这种现象称为胎萌。种子在贮藏时如果湿而热也会萌发。有些杂草种子由于休眠期的个体差异,或在土层内分布深度不同,在若干年内陆续萌发,使防除困难。