细胞凋亡

1. 细胞凋亡 Apoptosis programmed cell death, PCD 徐霞

2. 凋亡细胞的形态学和生化特征： 细胞皱缩 质膜出泡 染色质浓缩 DNA裂解：DNA ladder 磷脂酰丝氨酸由质膜内侧翻转至外侧 凋亡小体的释放

3. 核酸内切酶活化与DNA片段化是凋亡的生物化学标志。 • DNA链上每隔200个核苷酸就有1个核小体，当核酸内切酶在核小体连接部切开DNA时，即可形成180～ 200bp或其整倍数的DNA片段。这些片段在琼脂糖凝胶电泳中可呈特征的阶梯状（ladder）条带，是判断细胞凋亡的客观指标之一。

4. DNA ladder endonucleolytic DNA fragmentation nucleosome core histone DNA 180bp chromatin

5. 细胞凋亡过程（四个阶段）： 1. 凋亡信号转导 2. 凋亡基因激活 3. 凋亡的执行（由DNase 和caspases执行） 4. 凋亡细胞的清除。

6. 细胞凋亡信号的转导 凋亡诱导因素 作用于 细胞 转化为 凋亡信号 胞内信号转导途径 激活细胞死亡程序 细胞凋亡（DNA片段化及蛋白解体等）。 细胞凋亡主要有三条通路： • 外源性通路（死亡受体途径） Fas, TNF… • 内源性通路（线粒体途径） • 内质网通路

7. 细胞凋亡的三条通路 死亡配体 死亡受体 紫外线等 （如FasL）→（如Fas）→FADD→Caspase-8→凋亡酶体 ↓ ↓ DNA损伤 线粒体→Cytc→Apaf-1→Caspase-9→Caspase-3、6、7- ↓ ↓ P53↑ ↓ ↓ 底物 Bax↑、Bcl-2↓ ↓ 神经酰胺 细胞凋亡 内质网中Ca离子过多 未折叠的蛋白质积累→ →Bax/Bak→ →caspase-12

9. 半胱天冬酶（胱冬酶，Caspase，Cysteine-containing aspartate-spicific protease） • Asp特异性半胱氨酸蛋白水解酶 • 可特异水解底物蛋白分子中天冬氨酸残基羧基侧的肽健，且对此Asp前面的4个氨基酸残基有要求。从而激活该蛋白质或改变蛋白质的活性，从而促进细胞凋亡。 N···· A-B-C-D-Asp-X ····C • 不同的Caspase对ABCD种类要求不同。

10. Caspase的分类 （1）上游/启动型caspase: 2、8、9、10、12等 处于细胞凋亡信号传递途径的上游，在凋亡信号的刺激下首先被激活，然后再水解激活下游的caspase,启动细胞的凋亡过程; （2）下游/执行型caspase: 3、 6 、7等 处于细胞凋亡信号传递途径的下游，是在细胞凋亡过程中的具体执行者，被上游caspase激活后直接水解与细胞凋亡有关的底物蛋白，引起细胞形态和生物化学改变。

11. Caspase的底物 • 100多种 • 细胞骨架蛋白：核纤层蛋白、肌动蛋白、核分裂相关蛋白等十几种蛋白→染色质聚集浓缩。 • 与DNA损伤修复相关的蛋白质和酶，阻止DNA损伤的修复。如：DNA依赖性蛋白激酶、DNA复制相关蛋白、聚（ADP-核糖）多聚酶（PARP）。 • 激活DNA酶，促进DNA断裂等。

12. Caspase的作用 在诱导细胞凋亡中起关键作用，成为细胞凋亡的“中心处理器”。 Caspase是细胞凋亡的执行者，引起细胞凋亡的各种因素通过凋亡信号传递途经最终激活caspase，caspase通过水解不同的蛋白质改变细胞特性，引起细胞凋亡。但并非所有的凋亡过程都有caspase的参与。

13. 细胞凋亡实验 Hela细胞培养至70-80% 接合，加30μL 大蒜素，培养2hr. ↓ 去除培养液，加PBS 500μL，细胞刮刀刮出细胞吸至EP管， 再用PBS 500μL洗平皿，2000rpm离心2min，弃上清. ↓ PBS洗1遍，离心收集细胞（2管） DNA Ladder Caspase-3活性检测 1管 1管

14. DNA Ladder 细胞沉淀中加入200微升PBS，轻轻吹散或弹散细胞，使细胞重悬于PBS中。 ↓ 加入4微升RNase A，Vortex混匀。室温放置2分钟 ↓ 加入20微升蛋白酶K，Vortex混匀 ↓ 加入200微升样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟 （加入样品裂解液B后必须立即Vortex混匀。不可把蛋白酶K直接和样品裂解液B混合） ↓ 加入200微升无水乙醇，Vortex混匀 （加入乙醇后必须充分混匀，否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内） ↓ 把上述混合物加入到DNA纯化柱内，8000rpm离心1分钟。倒弃收集管内液体。 ↓ 加入500微升洗涤液I，8000rpm离心1分钟。倒弃收集管内液体。 ↓ 加入600微升洗涤液II，12000rpm离心1分钟。倒弃收集管内液体。 ↓ 12000rpm离心1分钟，以去除残留乙醇 ↓ 将DNA纯化柱置于一洁净的1.5ml离心管上，加入50μL洗脱液。室温放置3分钟。 ↓ 12000rpm离心1分钟，所得液体即为纯化得到的总DNA。 （洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收）

15. 琼脂糖凝胶电泳 将抽提得到的DNA 50μL+10Loading buffer 6μL，混匀，上样进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。电压60V，时间3-4hr，观察DNA ladder的形成。

16. Caspase-3活性检测 细胞沉淀加入50微升裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15分钟 ↓ 12,000g离心15分钟 ↓ 把上清转移到预冷的离心管中 ↓ 立即测定caspase 3的酶活性。同时取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度 ↓ 设置反应体系： ↓ 加入Ac-DEVD-pNA (2mM)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37℃孵育2hr。发现颜色变化比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间 ↓ 计算caspase 3的酶活力单位

17. Bradford法测定样品蛋白浓度 室温放置5min 酶标仪测定样品的A570-空白对照的A570 (y) 根据公式计算样品蛋白浓度：y=0.0006x+0.0238

18. 样品中caspase 3催化生成的pNA的吸光度（y）=样品的A405-空白对照的A405 ↓ 通过标准曲线公式：y=0.0025x+0.0103，求出样品中催化产生的pNA的量。 ↓ 样品单位重量蛋白中所含caspase 3的酶活力单位 = 样品中酶催化产生pNA的量 / 待测样品蛋白浓度

19. 预试结果：DNA Ladder

20. 预试结果：caspase3标准曲线

21. 蛋白浓度测定标准曲线