Lezione n.2

1. Lezione n.2 Era Post Genomica Dott.ssa L. Lentini 2013

2. I neocentromeri • I neocentromeri sono centromeri ectopici che si formano occasionalmente in regioni non centromeriche, spesso all’interno di regioni del genoma codificanti. • I neocentromeri sono caratterizzati dall’assenza del DNA satellite, tipico dei centromeri canonici. Nonostante l’assenza di DNA α-satellite, i neocentromeri sono capaci di formare una costrizione primaria e di assemblare un cinetocore funzionale e stabile in mitosi. • La formazione dei neocentromeri è oggi un fenomeno • ben riconosciuto nell’uomo e fino ad oggi sono stati identificati circa 70 neocentromeri umani, tipicamente localizzati su cromosomi riarrangiati che hanno perso i loro centromeri.

3. Neocentromeri e malattie genetiche I neocentromeri sono stati spesso individuati anche in carcinomi umani. - La comparsa dei neocentromeri è spesso conseguenza di riarrangiamenti cromosomici che comportano la formazione di frammenti cromosomici acentrici infatti, nell’uomo, cariotipi con neocentromeri sono spesso associati a malattie genetiche. La presenza di neocentromeri in individui fenotipicamente normali fornisce un supporto all’ipotesi che la formazione dei neocentromeri sia un meccanismo associato con il riposizionamento dei centromeri durante l’evoluzione del cariotipo.

4. Il riposizionamento del centromero mediante emergenza di un centromero è un fenomeno ben dimostrato all’interno dei Primati. Nel genoma umano i neocentromeri mostrano dei siti privilegiati di formazione, infatti esistono delle regioni cromosomiche che sono degli “hot-spots” di neocentromerizzazione. Tali regioni sono il braccio lungo del cromosoma 3, 13, 15 e Y e il braccio corto del cromosoma 8 e 9.

5. Ipotetico Cariotipo ancestrale di tutti i Primati con numero diploide 2n=50 costruito mediante “painting” cromosomico comparativo. Ogni cromosoma è rappresentato da un rettangolo, Il numero all’interno indica l’omologia con i cromosomi umani. Ogni sintenia cromosomica umana è indicata con un colore diverso.

6. Ipotetico Cariotipo ancestrale di tutti i Primati con numero diploide 2n=50 costruito mediante “painting” cromosomico comparativo. Ogni cromosoma è rappresentato da un rettangolo, Il numero all’interno indica l’omologia con i cromosomi umani. Ogni sintenia cromosomica umana è indicata con un colore diverso. Il caso più noto riguarda il cromosoma 2 dell’uomo che deriva dalla fusione di due cromosomi acrocentrici e dalla disattivazione di un centromero in posizione 2q21.1

7. La storia del cromosoma 14 e 15 Storia evolutiva dei cromosomi 14 e 15 dell’uomo mediante il mappaggio di sonde BAC e relazione tra neocentromeri e nuovi centromeri evolutivi. I cromosomi 14 e 15 derivano dalla fissione di un cromosoma ancestrale presente nel comune antenato degli Hominidae (umani e grandi scimmie). Il mappaggio delle sonde BAC indica che l’ordine dei marcatori è conservato in macaca e nei due cromosomi umani. La fissione è avvenuta nella regione tra il marcatore F e G (Ventura et al., 2003). Si formano due nuovi centromeri: uno nella regione telomerica del cromosoma 15, l’altro in corrispondenza del punto di fissione sul cromosoma 14. Il centromero ancestrale mappa in corrispondenza dell’apparente suddivisione del marcatore E. In corrispondenza del centromero ancestrale 15q24-26 si riscontrano i neocentromeri umani. C= centromero; AC=centromero ancestrale; NC= nuovo centromero; N=Neocentromeri clinici

8. 2008 Articolo neocentromeri Rappresentazione schematica di siti costitutivi del genoma umano con presenza di neocentromeri (Marshall, 2008).

9. Hot Spots di formazione di neocentromeri (giallo) su braccio lungo 13q (Marshall, 2008).

10. Qual è la principale causa di formazione di neocentromeri nell’uomo? -Riarrangiamenti dopo rotture di cromatidi

11. Qual è la principale causa di formazione di neocentromeri nell’uomo? -Riarrangiamenti dopo rotture di cromatidi

12. Neocentromeri e cancro • In generale la formazione di neocentromeri è un evento abbastanza raro, però risulta più frequente in alcune forme di cancro in cui si osservano complessi riarrangiamenti cromosomici. • -es. Lipoma e Liposarcoma • Il miglior collegamento caratterizzato tra neocentromeri e una specifica forma di cancro si trova nei lipomi atipici e nei liposarcomi .

13. Lipomi atipici e Liposarcomi Il lipoma è un tumore benigno dei tessuti molli formato da cellule adipose (lipociti) maturi. Più spesso situato tra la pelle e lo strato muscolare sottostante. ‘Pastoso al tatto. Possono verificarsi a qualsiasi età, ma sono più spesso rilevati durante la mezza età. Talvolta il lipoma può contenere, oltre al predominante tessuto adiposo, anche tessuti di altro genere quali tessuto fibroso, cartilagine o osso: in questo caso viene chiamato lipoma atipico. Il lipoma è costituito da un insieme di adipociti a lentissima crescita, ben capsulato, che cresce progressivamente, raggiungendo anche grandi dimensioni, senza infiltrare i tessuti molli adiacenti. Quando è multiplo si chiama lipomatosi. La degenerazione maligna di un lipoma è descritta ma è molto rara; nei rari casi avviene nei lipomi di vecchia data e di grandi dimensioni.

14. Si manifesta indistintamente in entrambe i sessi Eta’

15. Lipomi atipici e Liposarcomi Il liposarcoma è la forma maligna del lipoma, è una neoplasia del tessuto adiposo, può comparire in qualunque parte del corpo. A differenza della sua forma benigna il liposarcoma compare più in profondità, al tatto può essere duro. Si manifestano più frequentemente in addome (in sede retroperitoneale), ma si possono sviluppare anche nel collo, nel subendocardio o nel subpericardio e anche in altre parti del corpo. Questi tumori sono contrassegnati da un elevato numero di cromosomi ad anello privi di DNA alfa-satellite, composto prevalentemente da DNA amplificato delle sequenze 12q14-15. Tale cromosoma possiede un neocentromero nella costrizione primaria. In realtà si è visto che non c’è una correlazione diretta tra DNA amplificato e neocentromero.

16. Neocentromeri in grandi cromosomi marker sono stati osservati anche in altri tipi di tumore: • -Tumore al polmone (alcuni casi) • AML • In realtà si pensa che potrebbero essere caratteristiche di molti più casi di tumore non riportati in letteratura, per il motivo che spesso non si fa uno studio del cariotipo nei tumori. • Lavori su CRC e CENP -A

17. Centromere protein (CENP) -A is the centromere-specific histone-H3-like variant essential for centromere structure and function. It plays a central role in the assembly of the protein complex, termed kinetochore, which is indispensable for equal chromosome segregation. In this study, we demonstrate that the kinetochore protein CENP-A was overexpressed in all of 11 primary human colorectal cancer tissues. CENP-A mRNA was also upregulated, indicating that overexpression of CENP-A occurred at the transcriptional level.

18. Immunostaining with anti-CENP-A antibodies showed increased CENP-A signals in the tumor cells. Moreover, coimmunostaining of CENP-B, a centromere-associated DNA binding protein, with CENP-A showed mistargeting of CENP-A to noncentromeric chromatin in the tumor cells. These results suggest that overexpression of CENP-A could play an important role for aneuploidy.

19. Caratteristiche cliniche di pazienti con CRC

20. Duke Classification

21. Fig. 1. CENP-A protein was increased in primary colorectal cancers. Total protein lysates were prepared from matched samples of tumor (T) and adjacent normal tissue (N). Equal amounts of protein from each pair were resolved on 7.5–15% gradient polyacrylamide gel and immunoblotted with several antibodies. A, CENP-A protein is indicated by the arrow. Immunoblotting was also performed with -actin antibody as a loading control. Intensity of each band was measured by NIH Image, and the relative mean CENP-A protein levels between tumor and normal tissue normalized with -actin were calculated from at least three experiments. shows a nonspecific band. Dukes’ stage of each tumor is noted. B, CENP-A protein levels were detected with anti-CENP-A antibody instead of ANA serum. C, CENP-B protein detected with ANA serum. D, PCNA protein levels in colorectal cancer tissues.

22. Valutazione dell’espressione dell’mRNA CENP-A Fig. 2. CENP-A gene is overexpressed but not amplified in colorectal cancer. A, total RNAs were prepared from matched samples of tumor (T) and adjacent normal tissue (N), and RT-PCR was performed. Intensity of each band was measured by NIH Image, and the relative mean CENP-A mRNA levels between tumor and normal tissue normalized with GAPDH mRNA levels were calculated from at least three experiments. In most of the cases, CENP-A mRNA in tumors was increased when compared with in normal tissues. B, comparison of CENP-A mRNA levels between tumors and adjacent normal tissues by real-time quantitative RT-PCR. C, quantitation of CENP-A gene copy number in tumors and normal tissues by real-time quantitative PCR; bars, SD.

23. Fig. 3. Immunostaining of human colon tissue with anti-CENP-A antibody. Normal colon epithelium (A and B) and colon cancer tissue (C and D) were fixed with 4% paraformaldehyde and were stained with H&E (A and C) or with anti-CENP-A antibody (B and D). CENP-A staining was increased in the cancer cells when compared with the normal epithelial cells. Immunolocalizzazione di CENP-A

24. Fig. 4. Coimmunostaining of human colon tissue with anti CENP-A and anti CENP-B antibodies. A, normal colon epithelium and colon cancer tissue were fixed with acetone, and were stained with anti-CENP-A and anti- CENP-B antibodies. Arrowheads show the CENP-A thatdoes not colocalize with CENP-B. Arrows show the CENP-B that does not colocalize with CENP-A. Whereas all of the CENP-A and CENP-B colocalize in normal cells, some of the CENP-A and CENP-B signals do not colocalize in tumor cells. B, number (%) of CENP-A and CENP-B dots that colocalize or do not in normal and tumor cells. At least 300 dots of cells were counted

25. Abstract • Sarcomatoid carcinoma of the lung (LSC) is a rare lung cancer characterized by an admixture of carcinoma and sarcoma components. • Here, we report on the first molecular cytogenetic characterization of a metastatic LSC. Cytogenetic and multicolor fluorescence in situ hybridization (M-FISH) analyses showed a near-triploid karyotype with numerous structural aberrations and four to six small supernumerary marker chromosomes containing chromosome 9 sequences. • Comparative genomic hybridization on arrays (array CGH) detected an amplification of 9p23∼p24.3 and gains of 1q11∼q23.3, 3q26.2∼q29, and 17q23.2∼q24.1. The 9p amplification was also detected in the primary tumor and another metastasis of the same patient, indicating it was a significant element in the pathogenesis of this LSC case. Complementary FISH analysis showed that the small supernumerary chromosomes were isochromosomes for 9p23∼p24.3. This case is the third description of the identification of neocentromeres in cancer, (i.e. well-differentiated liposarcoma and acute myeloid leukemia), and is the first one in a carcinoma.

26. Attivazione del pathway di JAK Porta al rilascio di citochina pro-infiammatorie STAT

27. Cromosomi come organelli funzionali: il telomero I telomeri sono strutture specializzate, che comprendono DNA e proteine, sono alle estremità dei cromosomi eucariotici. Essi hanno diverse funzioni probabili: Mantenengono l'integrità strutturale di un cromosoma. Se un telomero è perso, alla fine il cromosoma risultante è instabile. Ha tendenza a fondersi con l'altra estremità di cromosomi rotti, di essere coinvolti in eventi di ricombinazione o di essere degradati. Garantiscono la replicazione completa della estremità dei cromosomi.     *Contribuiscono alla architettura tridimensionale del nucleo e l'appaiamento dei cromosomi. Estremità dei cromosomi sembrano essere legate alla membrana nucleare, suggerendo che i telomeri aiutano i cromosomi a mantenere la loro posizione.

28. STUDIO CROMOSOMI UMANIANOMALIE

29. Lo studio dei cromosomi umani Lo studio dei cromosomi umani rende necessario ottenere dei campioni dai quali potere visualizzare i cromosomi: .-sangue, linfociti T -pelle, fibroblasti -analisi prenatali, amniociti e villi -Stimolazione alla divisione -Procedura per la preparazione di metafasi

30. Di numero trisomie monosomie triploidie tetraploidie Di struttura traslocazioni inversioni delezioni duplicazioni Quali sono le anomalie cromosomiche

31. ANOMALIE DI NUMERO

33. POLIPLOIDIE • la più comune è la TRIPLOIDIA dovuta a fecondazione di un singolo ovulo da parte di due spermatozoi (DISPERMIA) o dalla fecondazione che coinvolge un gamete diploide anomalo. • TETRAPLOIDIA: dovuta al non completamento della prima divisione zigotica

35. ANEUPLOIDIA MONOSOMIE e TRISOMIE • NON-DISGIUNZIONE: incapacità di cromosomi di separarsi durante la prima divisione meiotica, o dei cromatidi fratelli appaiati di separarsi nella seconda divisione meiotica. I due cromosomi o cromatidi congiunti migrano ad un polo e vengono inclusi in una sola cellula figlia, mentre l’altra avrà materiale genetico in meno • RITARDO ANAFASICO: ritardata migrazione del cromosoma durante l’anafase, conseguente perdita del cromosoma. Mancata incorporazione di un cromosoma nel nucleo di una delle cellule figlie.

37. La non disgiunzione • Esistono fattori che influenzano la non disgiunzione ? Non ben conosciuti • Dove e quando avviene la non disgiunzione ? Più frequentemente nella I ° meiosi materna

38. Non disgiunzione I

39. Non disgiunzione II

40. MIXOPLOIDIA • MOSAICISMO: due o più linee cellulari derivanti dallo stesso zigote, dovute ad una non disgiunzione o ritardo cromosomico verificatisi in una delle divisioni mitotiche in fase embrionale precoce. • CHIMERA: due o più linee cellulari diverse che originano da zigoti differenti

41. Come si forma un mosaico? ZIGOTE

42. CHIMERE E MOSAICI

43. Anomaliedistruttura • Delezioni • Duplicazioni • Inversioni • Translocazioni

45. Gravità delle anomalie cromosomiche • La gravità è correlata al tipo di cromosoma e alla quantità di geni interessati. • Tanto più grave è lo sbilanciamento cromosomico tanto più precoce sarà l’interruzione di gravidanza.

46. La frequenza delle anomalie cromosomiche è: • Direttamente correlata con l’età materna • Inversamente correlata con l’epoca gestazionale

47. Screening Prenatali Amniocentesi Villocentesi Trasluc Nucale Osso ioide La percentuale di bambini Down con Trisomia 21 aumenta progressivamente con l'aumentare dell'età materna al parto ….ma anche i papà devono stare attenti!!

48. La traslucenza nucale è una piccola raccolta di liquido che si trova sotto la pelle della zona cervico-dorsale in tutti gli embrioni fra le 10 e le 14 settimane di gravidanza. Le ragioni della presenza di tale falda liquida non sono ancora ben chiare, ma si è visto che in presenza di un aumento dello spessore della traslucenza cresce anche il rischio che il feto sia affetto da alcune patologie congenite quali le cromosomopatie, le cardiopatie ed altre sindromi genetiche o malformative. Questo marker è in grado di identificare il 75% circa dei casi di Sindrome di Down

49. -Esiste inoltre una diretta correlazione tra aumento dell’età paterna ed elevato rischio di difetti congeniti nel feto. -In uno studio recente è emerso che il rischio di aborto, se il padre ha più di 40 anni, è maggiore di circa il 60 % rispetto a gravidanze in cui il padre ha un’età inferiore ai 30 anni.

50. Initial impact of the sequencing of the human genome Eric S. Lander1 Nature Volume: 470, Pages: 187–197 Date published: (10 February 2011)