Técnicas de Estudio a Nivel Molecular

1. Técnicas de Estudio a Nivel Molecular DNA RNA • - Southern Blot • PCR • FISH • Secuenciación -Northern Blot -RT-PCR -Microarray

2. Técnicas mas utilizadas para el estudio de DNA

3. Enzyme Site Enzyme Site AluI AG'CT NotI GC'GGCCGC BamHI G'GATCC PstI CTGCA'G BglII A'GATCT PvuII CAG'CTG EcoRI G'AATTC SalI G'TCGAC HaeIII GG'CC Sau3AI 'GATC HhaI GCG'C SmaI CCC'GGG HincII GTY'RAC SpeI A'CTAGT HindIII A'AGCTT TaqI T'CGA HinfI G'ANTC XbaI T'CTAGA HpaII C'CGG XhoI C'TCGAG KpnI GGTAC'C XmaI C'CCGGG MboI 'GATC Enzimas de restricción (endonucleasas) De origen bacteriano. Reconocimiento y corte de secuencias especificas (palindromicas) de 4 a 6 pb Sistema de protección bacteriana.

4. Formación de extremos cohesivos ---G´ 3´5´ GATCC--- ---CCTAG 5´3´ ’G--- BamHI 5´--G‘ GATCC--3´ 3´--CCTAG’ G--5´ Formación de extremos romos HaeIII ---GG CC--- ---CC GG--- HincII ---GTC GAC--- ---CAG CTG--- ---GG CC--- ---CC GG--- ---GTC GAC------CAG CTG---

6. USOS • Tecnología de DNA recombinante • Inserción en plásmidos • Creación de moléculas híbridas • Mapas de restricción (caracterización de un gen) • Análisis de mutaciones • Creación de bibliotecas genómicas • Preparación de la muestra para técnicas posteriores (por ej. Southern Blot)

7. Southern Blot

8. Dos muestras A y B de simple cadena Se blotearon sobre la membrana Se Incuba con la sonda marcada Se revela por autoradiografía o por quimioluminiscencia. Solo la sonda complementaria se “pega” a la secuencia correspondiente

9. Gel de agarosa 0.7% con 14 muestras corridas Tras la digestión con EcoRI. Placa radiográfica revelando las cepas positivas Para el gen de interés.

11. Polymerase Chain Reaction • Desarrollada por Kary Mullis en 1983 en California y publicada por primera vez en Science en 1985. • Amplificación de fragmentos específicos de hasta 10.000 bp • Ensayo de corta duración, de alta especificidad y reproducibilidad • Pequeñas cantidades de DNA • Se necesita conocer la secuencia o al menos la sec. flanqueante Preparación de la mezcla Ciclos de Temperatura Análisis de resultados Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., and Erlich, H. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science230: 1350-54

12. PCR Termocicladores modernos Máquina de PCR primitiva

13. Real Time PCR Técnica utilizada para monitorear el progreso de una reacción de PCR a medida que transcurre (tiempo real).  Pueden detectarse y cuantificarse cantidades mínimas de producto de PCR (DNA, cDNA or RNA). Está basado en la detección de fluorescencia producida por una molécula reportera. Esto ocurre debido a la acumulación del producto de PCR en cada ciclo de amplificación. Estas moléculas fluorescentes pueden ser colorantes que se unen a la doble hebra de DNA (ej. SYBR® Green ) o secuencias específicas (ej. Molecular Beacons or TaqMan® Probes). No es necesario pos procesamiento de la muestra. Real time PCR es fácil de llevar a cabo, con alta sensibilidad y mayor especificidad También puede estudiarse expresión mediante el uso de RNA como molde

15. Secuenciación de DNA

16. Método de Sanger

17. FISH

18. Y un colado!!!!! Estudios de cariotipo Detección de translocaciones Hibridación in situ para localización de expresión en tejidos. a) embrión de pez b) nucleolo Cromosomas marcados con sondas teloméricas

19. Técnicas mas utilizadas para el estudio deRNA

20. RT-PCR

21. Northern Blot

22. Y LO MAS NUEVO!!!!.... LO QUE ESTÁ DE MODA.....

23. Microarray