ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

2. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ – перераспределение материала между молекулами или внутри молекулы ДНК, приводящее к появлению новых комбинаций генов или других нуклеотидных последовательностей. Отдельное место занимает рекомбинация на уровне РНК у некоторых РНК-содержащих вирусов (пикорнавирусы, коронавирусы). Рекомбинация между молекулами ДНК представляет широкий набор различных по генетическому контролю и молекулярным механизмам. В отличие от других генетических процессов (репликация, репарация и др.), для рекомбинации необходим физический контакт между рекомбинирующими участками ДНК – СИНАПСИС. Исходя из молекулярных механизмов, генетического контроля и природы синапсиса, все известные рекомбинационные процессы можно подразделить на следующие типы:

3. ГОМОЛОГИЧНАЯ или ОБЩАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ или КРОССИНГОВЕР Здесь синапсис основан на спаривании цепей ДНК с комплементарными основаниями, для чего необходимо наличие протяженной гомологии между рекомбинирующими последовательностями. Чтобы обнажить комплементарные одноцепочечные (однонитевые – ОН) участки для синапсиса, необходимы разрывы и определенная деградация цепей ДНК. Процессы гомологичной рекомбинации осуществляют большие группы специальных белков. Из общей следует выделить ЭКТОПИЧЕСКУЮ рекомбинацию. По существу, она является неаллельной. Эктопическая рекомбинация заключается кроссинговерах между отдельными повторяющимися гомологичными последовательностями ДНК, тандемными или диспергированными по геному, что приводит к различным хромосомным перестройкам. По генетическому контролю, молекулярному механизму и природе синапсиса эктопическая рекомбинация относится к гомологичной.

4. Остальные типы рекомбинации не нуждаются в гомологии. Природа синапсиса у них принципиально иная: специальные белки узнают определенные последовательности ДНК и связываются с ними; образовавшийся ДНК-белковый комплекс входит в контакт (синпсис) с негомологичным дуплексом ДНК и осуществляет между ними обмены цепями. Типы негомологичной рекомбинации: САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ происходит между определенными нуклеотидами, находящимися в специальных рекомбинационных сайтах. Широко распространена у вирусов и бактерий, единственный известный случай у эукариот – 2µ-плазмида у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Ключевыми ферментамисайт-специфической рекомбинации всегда являются сайт-специфические тороизомеразы типа I. Поэтому рекомбинация является консервативной, то есть осуществляется без каких-либо фиксированных повреждений или деградации ДНК и не нуждается в источниках энергии типа АТР.

5. ТРАНСПОЗИЦИИ – обширная группа рекомбинационных процессов, осуществляющих перемещения особых МОБИЛЬНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭЛЕМЕНТОВ из одного участка генома в другой. НЕЗАКОННАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ. К ней относят рекомбинационные процессы между негомологичными ДНК, осуществляющиеся помимо сайт-специфической рекомбинации и транспозиций. У бактерий известен механизм обмена между негомологичными ДНК с использованием ДНК-гиразы, у эукариот основным является процесс соединения концов негомологичных дуплексов ДНК – non-homologous DNA end-joining (NHEJ).

6. ГОМОЛОГИЧНАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

7. Эктопическая рекомбинация Эктопическая рекомбинация – частный случай гомологичной рекомбинации. Она осуществляется между повторяющимися гомологичными последовательностями ДНК, тандемными или диспергированными по геному, что может приводить к разнообразным хромосомным перестройкам.

8. Тип возникающей перестройки зависит от ориентации повторяющихся последовательностей ДНК (прямая или обратная) и от их локализации (в одной хромосоме, в сестринских хроматидах, в гомологичных или в разных хромосомах). Рассмотрим два примера эктопической рекомбинации в случае прямых повторов ДНК.

10. Молекулярные механизмы гомологичной рекомбинации Модель Холлидея,1964 г.

11. Р.Холлидей предложил молекулярную модель кроссинговера с целью объяснения некоторых закономерностей мейотической рекомбинации, выявленных им и многими другими исследователями, использовавшими систему тетрадного анализа у грибов аскомицетов и базидиомицетов. Прежде всего, из результатов этих исследований было известно, что мейотическая генная конверсия может сопровождаться, а может не сопровождаться кроссинговером по генетическим маркерам, внешним (фланговым) по отношению к сайту конверсии. При этом частоты «конверсии без кроссинговера» и «конверсии с кроссинговером» равны. Объяснение именно этого факта было задачей Холлидея. В то время (1964 год) молекулярная генетика только зарождалась. В том же году была только-только открыта эксцизионная репарация. Но еще почти ничего не было известно о белках, осуществляющих репарацию повреждений ДНК и рекомбинацию. В таких условиях Холлидей выдвинул гениальную идею, что в основе генной конверсии лежит репарация (коррекция) неспаренных оснований в гетеродуплексе, формирующемся при обмене цепями между рекомбинирующими ДНК. Рекомбинационный гетеродуплекс – участок, состоящий из двух цепей, происходящих от разных родительских дуплексов ДНК.

13. При создании модели Холлидей постулировал следующие допущения: 1. Для инициации рекомбинации необходимы первичные разрывы цепей ДНК. 2. Разрывы возникают не в случайных, а в определенных сайтах, которые Холлидей назвал «рекомбинаторами». В настоящее время такие реально существующие сайты мы называем «горячими точками» (hot spots) рекомбинации. 3. Первичные разрывы возникают в цепях ДНК ОДИНАКОВОЙ полярности. 4. Для разрешения крестообразных структур (полухиазм), возникающих в результате обмена цепями между дуплексами ДНК, необходимы вторичные разрывы двух типов: 1) в точке перекреста цепей и 2) в интактных, не участвовавших в первом акте обмена, цепях напротив точки перекреста. Разрывы обоих типов РАВНОВЕРОЯТНЫ. На представленном на следующем слайде рисунке линии соответствуют цепям ДНК, две параллельные линии – дуплексу ДНК (хроматиде). Для простоты восприятия рисунка на нем представлены то две из четырех хроматид мейотической тетрады, то есть только те две, которые участвуют в процессе кроссинговера. Полустрелки обозначают полярность цепей ДНК.

14. Модель Холлидея (Holliday, 1964).Представлена в оригинальном (А, Б, Д, Е) и современном (В, В‘, Г, Д, Е) виде

15. Из рисунка видно, что рекомбинантные хроматиды с гетеродуплексом (следовательно, с конверсией в гене В) без с кроссинговерапо фланговым генам А и С (рис. Д) и структуры с конверсией, но с кроссинговером по фланговым маркерам (рис. Е) должны возникать равновероятно, так как равновероятны вторичные разрывы обоих типов. Именно это стремился продемонстрировать Холлидей. Впоследствии реальность модели Холлидея была подтверждена электронно-микроскопическими и биохимическими данными. Как будет видно из последующего изложения, все белки, осуществляющие приведенные в схеме Холлидея реакции, были идентифицированы. Более того, модель Холлидея оказалась универсальной для гомологичной рекомбинации у всех видов организмов.

16. Электронно-микроскопическая фотография структур Холлидея

17. Сохраняя свою значимость, модель Холлидея постоянно развивалась. На следующем слайде в сокращенном виде представлена схема рекомбинационной репарации двунитевых разрывов (ДНР) ДНК, предложенная Жостаком и др. (1983). По этой схеме двунитевые концы ДНК в сайте разрыва подвергаются экзонуклеолитической деградации 5’-Р-концевых цепей, в результате чего формируются рекомбиногенные 3’-OH-концевые цепи. Последние внедряются в интактный гомологичный дуплекс ДНК с образованием двойных полухиазм Холлидея. Доказано, что по этой схеме осуществляется и мейотическая рекомбинация. Позднее такую структуру с двумя полухиазмами удалось препаративно выделить из мейотических клеток дрожжей и продемонстрировать ее реальность с помощью электронного микроскопа.

18. Модель рекомбинации на основе репарации двунитевых разрывов ДНК(double-strand break repair – DSBR)(Szostak, Orr-Weaver, Rothstein and Stahl, 1983)

19. ОСНОВНЫЕ БЕЛКИ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ГОМОЛОГИЧНОЙ РЕКОМБИНАЦИИ Процесс гомологичной рекомбинации разделяют на 3 основные стадии: ПРЕСИНАПСИС – подготовка ДНК-субстрата к рекомбинации: введение разрывов, образование участка ОН ДНК, формирование на ОН ДНК RecA-ДНК-филамента. СИНАПСИС – нахождение гомологии и обмен цепями между рекомбинирующими ДНК. ПОСТСИНАПСИС – миграция и разрешение структуры Холлидея. По этим стадиям принято распределять белки, осуществляющие рекомбинации.

20. ГЛАВНЫЙ БЕЛОК гомологичной рекомбинации уE.coli –RecA. Мономер белка имеет размер около 37,8 kDa. В таком виде он неактивен. Для активации необходимы АТФ и однонитевая (ОН) ДНК, представленная в любом виде: хвост, брешь, фрагменти даже олигодезоксинуклеотид. В условиях in vitro мономеры белка RecA в присутствии АТФ кооперативно связываются с ОН ДНК и формируют вокруг нее правозакрученную белковую спираль (не путать с правозакрученной спиралью ДНК). Эта вытянутая по длине структура получила название «RecA-ДНК-филамент» или «пресинаптическая структура». В первых этапах формирования филамента участвует белок SSB, который распрямляет цепь ДНК и позволяет белку RecA строить филамент, но затем SSB вытесняется белком RecA. В условиях in vivoв сборке филамента участвуют и другие дополнительные белки. Сборка филамента происходит в направлении 5’-3’ относительно цепи ДНК, вокруг которой он строится. В филаменте RecA связан с ДНК в стойхиометрическом соотношении 1 мономер белка на 3 н. и 6,2 мономера на виток спирали. Цепь ДНК располагается вдоль внутренней оси филамента. Если ОН ДНК находится в составе двунитевой (ДН) ДНК (ОН хвост или брешь), то формирующийся на ней филамент может перейти на дуплекс. Внутри филамента ДН ДНК вытянута в 1,5 раза по сравнению с В-формой ДНК.

21. RecA-филамент(вид сбоку). По (поP.R. Bianco andS.C. Kowalczykowski, Encyclopedia of life sciences, 2001, с изменениями). ДНК невидна. Показаны мономеры RecA в филаменте. Одна сторона мономера относительно гладкая, на другой отчетливо выступают 3 доли. В филаменте хорошо различим большой спиральный желоб. Соответственно конформации мономера RecA,одна сторона жолоба гладкая, другая, с выступающими долями, шероховатая. Желоб является сайтом связывания с LexA и другими эффекторными белками и, предположительно, с ДН ДНК.

22. RecA-ДНК-филамент представляет АКТИВИРОВАННУЮ форму белка RecA. Именно RecA-ДНК-филамент осуществляет ключевые стадии рекомбинации – синапсис и обмен цепями ДНК. RecA-ДНК-филаментможет взамодействовать только с «голой» (без филамента) ДНК.Рекомбинация происходит внутри филамента. Таким образом, для рекомбинации необходимо, чтобы одна ДНК уже была в составе филамента, а другая должна быть «голой».

23. Белок RecA в условиях in vitroспособен катализироватьразличные реакции с разнообразными ДНК-субстратами, но при соблюдении общих условий: 1. Хотя бы один из ДНК-субстратов должен быть хотя бы частично ОН. 2. Наличие АТФ. 3. Хотя бы один из ДНК-субстратов должен иметь свободный конец.

25. Реакция, представленная на рисунке В (предущий слайд) является модельной. Ее предпочитают практически все исследователи рекомбинационных функций белка RecA. C помощью этой системы было доказано, что именно 3’-концеваяОН ДНК является рекомбиногенной. Это правило распространяется на все живые организмы.

26. На примере той же модельной системы с ДНК фага ΦХ174 рассмотрим рекобинационные реакции, осуществляемые белком RecA in vitroболее подробно. ПРЕСИНАПСИС. Функциональная форма белка RecA представляет собой вытянутый RecA-ДНК-филамент (пресинаптическая структура), собранный на ОН ДНК.

27. СИНАПСИС представляет собой сложный процесс, включающий несколько этапов. RecA-ДНК-филамент способен осуществлять поиск гомологии в ОН или ДН ДНК. Поиск происходит путем кратковременных контактов (соударений) между случайными последовательностями в филаменте и в голой ДНК. Для этого голая (обычно это ДН ДНК) должна оказаться внутри филамента, где она «подраскручивается». В таком виде она «тестируется» на комплементарность с ОН ДНК филамента. Белок RecA каким-то образом получает сигнал, что гомология найдена. После того, как контакт установлен, белок RecA осуществляет обмен цепями ДНК между рекомбинирующими ДНК. Таким образом, в условиях in vitroбелок RecA способен осуществлять с помощью только одного белка SSB две основные стадии рекомбинационного процесса: пресинапсис и синапсис. В условиях in vivo в этих реакциях участвуют другие вспомогательные белки.

28. ПОСТСИНАПСИС – МИГРАЦИЯ ПОЛУХИАЗМЫ ХОЛЛИДЕЯ У E.coliмиграцию полухиазмы Холлидея осуществляют белки RuvA и RuvB.Белок RuvA узнает полухиазму и связывается с ней, после чего к образовавшемуся комплексу RuvA-полухизма рекрутируется белок RuvB. Белок RuvB проявляет свойства ДНК-хеликазы. Он собирается в виде гексамерных колец и, затрачивая энергию АТР, протягивает через эти гексамерные кольца оба гетеродуплекса. В результате полухиазма перемещается в 5’-3’-направлении, а гетеродуплекс удлиняется. В комплексе с белками RuvA и RuvB обычно работает резолваза RuvC, разрешающая полухиазмы Холлидея. Белки с такими же функциями выявлены и у эукариот.

31. Гены и белки гомологичной рекомбинации у E.coli

34. Биологическое значение гомологичной рекомбинации Лежит в основе репарации двунитевых разрывов хромосом - самого тяжелого типа повреждений ДНК, вызываемых ионизирующими излучениями или возникающих спонтанно. Вносит вклад в генетическую изменчивость, лежащую в основе эволюции. Необходима для правильного расхождения хромосом в мейозе и для самого мейоза.

35. Биологическое значение гомологичной рекомбинации Эктопическая рекомбинация Вносит существенный вклад в возникновение перестроек хромосом. Является одним из основных источников дупликаций генов и других последовательностей ДНК – это один из процессов, лежащий в основе эволюции генетического материала. Участвует в регуляции экспрессии генов путем онтогенетических перестроек генетического материала.

36. CАЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

37. Сайт-специфическая происходит между специфическими последовательностями ДНК в пределах коротких участков гомологии, обычно 15-30 п.н. При этом гомологичные последовательности для самой рекомбинации ненужны, они необходимы для их узнавания рекомбинационными белками. Сайт-специфическая рекомбинация широко распространена у бактерий и бактериофагов. Наиболее известные примеры сайт-специфической рекомбинации: интеграция фага лямбда и ряда других умеренных фагов в бактериальные хромосомы; обширная группа сайт-специфических инверсий у бактерий и фагов. Ключевыми белками сайт-специфической рекомбинации ВО ВСЕХ изученных случаях являются топоизомеразы типа I.

38. От обычных топоизомераз эти ферменты отличаются сайт-специфичностью, то есть они связываются с определенными последовательностями в ДНК и затем самостоятельно или с помощью других белков строят на ней сложные топологические структуры, необходимые для последующего обмена цепями. Процессы сайт-специфической рекомбинации принципиально отличаются от того, что происходит в случае гомологичной рекомбинации. При гомологичной рекомбинации эндонуклезы делают фиксированные разрывы фосфодифирных связей в цепях ДНК, и для восстановления этих связей необходимы ДНК-лигаза и источник энергии (например, АТФ). Напротив, реакции сайт-специфической рекомбинации являются консервативными в энергетическом отношении. Как известно, любая топоизомераза производит нефиксированные, временные (transient) разрывы цепей ДНК, при этом она образует ковалентную (фосфодиэфирную) связь с фосфатным остатком в точке разрыва, благодаря чему энергия исходной фосфодиэфирной связиконсервируется. Последующее замыкание концов в разрыве осуществляется без затрат внешней энергии.

39. Еще одной характерной особенностью сайт-специфической рекомбинации является упорядоченность и высокая точность ее реакций. Эти свойства обеспечиваются специфичностью сайт-специфических рекомбиназ и особой организацией ДНК-белковых комплексов, осуществляющих рекомбинацию.

40. Рассмотрим основные принципы функционирования интегразных систем на примере интеграции и эксцизии бактериофага λ в хромосому E.coli. После инфекции клетки E. coli линейная вирионная ДНК фага замыкается в кольцо за счет комплементарных одноцепочечных концов. Если последующее развитие фага идет по лизогенному пути, он интегрирует в хромосому бактерии между генами gal и bio. Интеграция происходит путем рекомбинации между особыми att (attachment)-сайтами: attP в хромосоме фага и attB – бактерии. Интегрированный фаг называется профагом. Он фланкирован рекомбинантными сайтами attL (левый) и attR (правый). Вырезание (эксцизия) профага из хромосомы при индукции происходит в обратной последовательности. Основные участники интегративной рекомбинации: Для интеграции необходимы сайты attP и attB, продукт фагового гена int – Int (интеграза) и гистоноподобный белок IHF (integration host factor) E. coli. Для эксцизии требуются сайты attL и attR, белки Int, IHF и фаговый белок Хis, который распознает только эти att-сайты (но неattP иattB) и экспрессируется только у профага.

41. Схема сайт-специфической рекомбинации у фага лямбда После проникновения в клетку линейная ДНК фага  замыкается в кольцо за счет имеющихся не ее концах комплементарных одноцепочечных последовательностей и превращается в ковалентно- замкнутую кольцевую молекулу

42. Схема сайт-специфической рекомбинации у фага лямбда 255 п.н. 22 п.н. attB (attachment site on the bacterial chromosome) attP (attachment site on the bacteriophage)

43. Схема сайт-специфической рекомбинации у фага лямбда 255 п.н. 15 п.н. 22 п.н. Int и Xis – фаговые белки IHF и FIS – бактериальные белки Профаг

44. Сайты attP и attB неравноценны. Первый устроен сложно. При размере около 270 п.н. он состоит из центральной (коровой) части О из 15 п.н. (из которых 12 – пары А-Т) и двух фланкирующих частей P и P'. Внутри сайта attP располагаются 7 участков связывания с интегразой Int, а также участки связывания с белками IHF и Xis. Сайт attB устроен проще. Его размер всего 23 п.н., гомология с attP ограничена коровой частью из 15 п.н., в которой имеются 2 сайта связывания с интегразой. Интеграза Int имеет 2 активности, обеспечивающие узнавание и связывание с ДНК в att-сайтах и топоизомеразную. В результате связывания attP с интегразой и белком IHF формируется сложно уложенная нуклеопротеидная структура , которая захватывает сайт attB и образует синаптический интермедиат (интасома), где рекомбинирующие последовательности att-сайтов удерживаются за счет взаимодействий между белками. Топоизомеразная активность Int используется для обмена цепями между att-сайтами.

45. НЕЗАКОННАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

46. К НЕЗАКОННОЙ (ILLEGITIMATE) РЕКОМБИНАЦИИотносят рекомбинационные процессы, происходящие либо вообще без гомологии между рекомбинирующими участками ДНК, либо с минимальной гомологией (2-5 п.н.). При этом к незаконной рекомбинации не относят сайт-специфическую рекомбинацию и транспозиции, которые также осуществляются без гомологии, но выделены в отдельные типы рекомбинационных процессов. В настоящее время к незаконной рекомбинации относят неточную эксцизию профага, приводящую к образованию специфических трансдуцирующих фаговых частиц, интеграцию чужеродной ДНК в хромосомы клеток млекопитающих при их трансфекции, соединение концов негомологичных дуплексов ДНК и т.д. У млекопитающих незаконная рекомбинация проявляется в виде соединения негомологичных концов ДНК – non-homologous end joining (NHEJ).

47. Основу NHEJ составляют два белковых комплекса: ПЕРВЫЙ комплекс включает белки Ku70 и Ku80, формирующие гетеродимер в виде полого внутри кольца. Ku-гетеродимер в свою очередь образует комплекс с каталитической субъединицей ДНК-протеинкиназы – DNA-PKcs. Этот комплекс называют ДНК-зависимой протеинкиназой – DNA-PK. Активность DNA-PK необходима для посадки Ku на ДНК,когда комплекс Ku-DNA-PKcs собирается на ее концах. Связывание Ku с концами ДНР стимулирует киназную активность DNA-PK. У млекопитающих в комплекс входит недавно (2002 год) обнаруженная нуклеаза Artemis (греческая богиня охоты Артемида), которая вскрывает шпилечные структуры на кодирующих концах ДНР, формируемых в ходе V(D)J-рекомбинации,и может удалять лишние нуклеотиды. Таким образом, роль комплекса заключается в узнавании, сближении концов ДНР. Считается также, что Ku и DNA-PKcs рекрутируют белки второго (лигазного) комплекса в NHEJ и стимулируют их к замыканию концов ДНК.

48. ВТОРОЙ (лигазный) комплекс состоит из каталитической субъединицы ДНК-лигазы IV, ее кофактора XRCC4, участвующего в этапе лигирования, а также недавно (2006 год) открытого белка XLF (XRCC4-like factor), получившего второе название Cernunnos (Цернун) в честь божества из кельтской мифологии. Функция комплекса – ковалентное замыкание концов ДНК.

49. РепарацияДНРДНКпутемnon-homologous endjoining (NHEJ) у млекопитающих ДНР DNA-PKCS Гетеродимер Ku80/Ku70 Artemis DNA-PK Сближение концов ДНК DNA-PKCS – каталитическая субъединица ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK); XRCC4 – X-ray-repair-cross-complementing defective repair in Chinese hamster mutant 4. Artemis – нуклеаза, разрезающая шпильки и осуществляющая процессинг концов ДНК Cernunnos/HLF участвует в сборке и стимулирует лигирование комплексом XRC4-лигазы IV Лигирование ДНК-лигаза IV XRCC4 XFL/Cernunnos

50. NHEJ широко распространен среди эукариотических организмов от дрожжей до млекопитающих. Основное назначение этого типа рекомбинации – репарация ДНР ДНК. У млекопитающих NHEJ является основным путем репарации ДНР ДНК. Соотношение между негомологичными и гомологичными путями рекомбинации/репарации у высших эукариот зависит от нескольких факторов, прежде всего от вида организма, типа клеток и фазы клеточного цикла. В G1 и в ранней S-фазе соматических клеток доминирует NHEJ. В течение S и G2, когда сестринские хроматиды могут активно использоваться в качестве матриц, преобладает гомологичная рекомбинация, но NHEJ также может функционировать. ДНР, индуцируемые белками RAG1 и RAG2 (V(D)J-рекомбинация) в лимфоидных клетках, восстанавливаются исключительно путем NHEJ. В гаметогенезе участвует исключительно гомологичная рекомбинация. В ранней мейотической профазе отсутствует белок Ku70, и репарация ДНР с участием неточной NHEJ невозможна.