Signaltransduktion in der T-Zellaktivierung

1. Signaltransduktion in der T-Zellaktivierung Reporter-Gen-Assay Molekulare Zellbiologie von Immunzellen Blockpraktikum SS 2008 Referenten: Felix Eppler, Sibylle Molt 10.07.08

2. Einleitung • Phosphorylierung der der Tyrosinreste der ITAMs durch Src-Kinasen • Rekrutierung der Syk-Kinase ZAP-70 • Aktivierung von ZAP-70 durch Tyrosin-Phosphorylierung von Lck und Fyn Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008

3. Zap70 • Tyrosinkinase  Phosphoryliert die Adapterproteine SLP-76 und LAT (linker of T cell activation) • Aktivierung der PL Cγ und Ras-Proteine • Ausgelöste Signalkaskade aktiviert die Transkriptionsfaktoren AP-1, NF-AT und NFκB  binden an die jeweiligen Erkennungssequenzen im IL-2 Promotor  Induktion der Synthese des IL-2 • IL-2 fördert die Proliferation und Differenzierung der T-Zelle

4. Cytohesin-1 • Guaninnukleotid-Austauschfaktor (GEF) für kleine ADP-Ribosylierungsfaktoren • Überwiegend in Zellen des hämatopoetischen System exprimiert • Wurde als spezifischer Interaktionspartner der β2-Untereinheit (CD18) des Integrins LFA-1 identifiziert (Kolanus et al.)

5. Ziel des Versuchs • Untersuchung des Einflusses von Zap70 und Cytohesin-1 auf den IL-2 Reporter und damit auf die T-Zellaktivierung • Ist Cytohesin-1 an Signalkaskaden der T-Zellaktivierung beteiligt? • Mutanten • Zap70K- inaktive Mutante (dominant negativ) • Zap70Y292F  funktionserhöhende Mutante Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008

6. Dominant-negative Cytohesin-1 Sec-7 Mutante (Cytohesin-1 E157K) in Jurkat E6 T-Zellen unterbindet nicht nur den GDP/GTP-Austausch an ARF1, sondern auch die LFA-1-vermittelte Adhäsion an ICAM-1 Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008

7. IL-2 Reporter-Gen Assay • Hinter der Promotor-Region wurde das IL-2 Gen durch eine Luciferase cDNA ersetzt  Luciferaseexpression wird dadurch u.a. von den Transkriptionsfaktoren AP-1, NF-AT und NFκB kontrolliert Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008

8. Luciferase Assay System • Luciferase spaltet das Substrat Luciferin in Anwesenheit von ATP zu Oxyluciferin • Die emittierten Photonen können mit Hilfe eines Luminometers detektiert werden Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008

9. Versuchsdurchführung • Elektroporation der LT-Zellen mit Marker (GFP), Reporter (IL2) und Test-DNA (Vektorkontrolle, Cytohesin1 wt, Cytohesin1 E157K, Zap70K-, ZAP70Y292F) • Stimulation der Zellen für 6 Stunden mit Okt3 (α CD3ε) und PMA (Phorbolester) • Überprüfung der Transfektionseffizienz  Bestimmung der GFP-Expression der einzelnen Transfektionen im FACS • Messung der Luciferase Aktivität (Luminometer) und Proteinkonzentration (mittels BCA) • Excel Auswertung

10. Ergebnisse Als Beispiel: Transfektionseffizienz von Cytohesin-1 E157K ermittelt durch FACS-Analyse (27,66%)

11. Ergebnisse

12. Ergebnisse Ergebnisse entsprechen den Mittelwerten aus 2 Experimenten

13. Diskussion • Vektorkontrolle stimuliert: • IL2-Promotor wird sehr effizient aktiviert • Vektor hat keinen Einfluss auf T-Zellaktivierung • ZAP70 K- stimuliert: IL2-Promotor wird kaum aktiviert ZAP70 hat eine wichtige Funktion im Rahmen der T-Zellaktivierung

14. Diskussion • ZAP70 Y292F stimuliert: schwache Aktivierung des IL2-Promotors Mutante scheint negative Einwirkung auf die T-Zellaktivierung zu haben Eine erhöhte Aktivierung des IL2-Promotors wäre zu erwarten gewesen (Zeitlmann et al., 1998) Müsste mit einem neuen Ansatz nochmals durchgeführt werden

15. Diskussion • Cytohesin-1 E157K stimuliert: sehr schwache Aktivierung des IL2-Promotors Dominant negative Mutante scheint negativen Einfluss auf T-Zellaktivierung zu haben • Cytohesin-1 wt stimuliert: sehr effiziente Aktivierung des IL2-Promotors leichte Steigerung gegenüber der Vektorkontrolle Cytohesin-1 scheint eine Rolle in der T-Zellaktivierung zu spielen