1 / 18

Úvod do studia cytologie a histologie

Úvod do studia cytologie a histologie. Základní pojmy. Metody studia buněk a tkání. Histologický preparát. Odběr, fixace, značení a zpracování vzorků. Základy mikroskopování. Ústav histologie a embryologie MUDr. Blanka Zajícová Obecná histologie a obecná embryologie, kód B02241.

carrington
Download Presentation

Úvod do studia cytologie a histologie

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Úvod do studia cytologie a histologie Základní pojmy. Metody studia buněk a tkání. Histologický preparát. Odběr, fixace, značení a zpracování vzorků. Základy mikroskopování. Ústav histologie a embryologie MUDr. Blanka Zajícová Obecná histologie a obecná embryologie, kód B02241

  2. Histologické vyšetření: • součást klinických vyšetřovacích metod • umožňuje stanovit diagnózu, rozpoznání nemoci je předpokladem správné léčby pacienta • metoda vědecké práce • Histologická technika • soubor postupů, metod a přístupů, které vedou ke zhotovení preparátu Preparát: • tenký řez tkáně (pro světelnou mikroskopii 6-8µm) • zpracován histologickou metodou • zamontován pod krycí sklo • připraven ke studiu pod světelným mikroskopem

  3. Odběr materiálu Způsoby odběru:1. Nekropsie – z mrtvého organismu, max. 12-24 h po smrti2. Biopsie – ze živého organismu (peroperační biopsie) Odběr musí být rychlý, šetrný a bezpečný pro pacienta. Excize – vyříznutí skalpelem, žiletkou, nesmí se příliš poškodit tkáň Punkce – širší jehla se stříkačkou, např. kostní dřeň, játra, ledviny Mikroabraze – kyreta, vyšetření endometria Stěr, nátěr – tamponem nebo štětečkem se oloupou buňky, např. poševní cytologie Endoskopický odběr, laparoskopie Odebrané vzorky musí být okamžitě fixovány, označeny. Průvodní list k zásilce histologického materiálu.

  4. Odběr materiálu Smrt – přerušení koordinační a obranné činnosti organismu, zásobení živinami a kyslíkem, odvodu metabolitů Autolýza – samovolný rozklad tkáně způsobený nekoordinovanou činností vlastních endogenních enzymatických systémů Hniloba – rozklad tkáně vnějšími činiteli (exogenní enzymy např. z bakterií, plísní) Autolýza i hniloba porušují strukturu a barvitelnost vzorku, takový vzorek nelze hodnotit. Zabránit znehodnocení lze rychlou fixací vzorku. Zásady odběru materiálu: Odebírat čerstvý materiál Šetrným způsobem Řádně označit Okamžitě fixovat Vyplnit průvodku

  5. Fixace Fixace - rychlá a šetrná konzervace tkáně fixačními prostředky • Fyzikální fixační prostředky: ovlivňují transportní funkci vody a tím naruší enzymaticky katalyzované reakce v buňkách- fixace působením nízké teploty: rychlé zmrazení, „suchý led“, zkapalněné plyny (tekutý dusík)- fixace vysušením tkáně za nízké teploty (freezing-drying): mrazová sublimace, histochemie – průkaz aktivity enzymů- fixace mikrovlnným zářením • Chemické fixační prostředky Založeny na působení par nebo roztoků účinných látek – fixačních tekutin, které ve vhodné koncentraci vyvolávají jemnou a šetrnou denaturaci enzymových proteinů. • Fyzikálně chemické metody - kombinace předchozích, např. chlazená fixační tekutina

  6. Požadavky na fixaci • musí rychle působit v celém vzorku • musí dobře uchovat strukturu buněk a tkání • musí umožňovat další požadované zpracování, vyšetření Z toho důvodu musí být vzorky přiměřeně velké: pro světelnou mikroskopii max. 1cm3, spíše ploténky. Fixační tekutiny musí být nadbytek – 20 až 50x větší objem. Vzorek se nesmí přilepit ke dnu ani plavat neponořený. Dostatečně velké hrdlo nádobky, řádné uzavření. Správné označení materiálu: nalepovací štítek + označení přímo ke vzorku. Nesmí dojít k záměně materiálu! Žádanka na histologické vyšetření.

  7. Fixační prostředky Formol: 100% formol je 40% vodný roztok formaldehydu Nejpoužívanější, dostupný, relativně levný. Neutrální formol: neutralizovaný uhličitanem vápenatým (asi ¼ láhve), běžně používaná koncentrace je 10% Rychle proniká do tkáně, je šetrný, zachovává strukturu, dobře se po něm barví. Fixujeme asi 24h, menší kousky i méně, nemůžeme přefixovat. slaný formol (ředěný fyziologickým roztokem) pufrovaný formol Bakerova tekutina: 10% formol, chlorid vápenatý, voda Vhodná pro průkaz lipidů, enzymů vázaných na membrány.

  8. Fixační prostředky Bromformol: 15% formol, bromid amonný Použití u impregnačních metod, průkaz gliových buněk v nervové tkáni. Bouinova tekutina: 25% formol, kys. pikrová, ledová kyselina octová - 5ml těsně před použitím Po fixaci se dává do 80% etanolu. Nemůže přefixovat. Nevýhody: nehodí se pro fixaci krevnatých orgánů, není vhodná pro průkaz lipidů

  9. Fixační prostředky Fixační tekutiny se sublimátem: SUSA: sublimát (chlorid rtuťnatý), chlorid sodný, formol, destilovaná voda, kyselina trichloroctová, před použitím ledová kyselina octová Výborná pro cytologii, kosti, zuby, chrupavky. Přenáší se rovnou do 90% etanolu, v němž se provádí jódování. Jódování – odstranění sublimátových sraženin (vznikají při fixaci) např. v Lugolově roztoku či jódové tinktuře. Zenkerova tekutina: sublimát, dvojchroman draselný, síran sodný, destilovaná voda, ledová kyselina octová, NENÍ FORMOL! Fixace 24h, pak vypírání bločku v tekoucí vodě (24h), pak 70% etanol a jódování.

  10. Fixační prostředky Etanol: použití zejména v neurohistologii – Nisslova metoda. Tkáň se značně dehydratuje a extrahují se tuky – zvýraznění komplexů granulárního endoplazmatického retikula (Nisslova substance), ta se pak barví např. thioninem. Aceton: 0-40C, enzymová histochemie Osmiumtetroxid: základní prostředek fixace v technice elektronové mikroskopie. Pro světelnou mikroskopii se nehodí – proniká pomalu do tkáně.

  11. Zalévání Pro běžné histologické vyšetření je potřeba odebraný a fixovaný materiál nakrájet na řezy 4-8µm silné. Po prosycení tkáně tekutým zalévacím médiem médium ztuhne a zvýší konzistenci (tvrdost, pevnost) vzorku, což umožní krájet tenké řezy. 1. Média rozpustná ve vodě: celodal, želatina, metakrylátové umělé pryskyřice Výhodná proto, že po fixaci a vyprání ve vodě můžeme přímo prosycovat, zalévat a tvrdit. 2. Média nerozpustná ve vodě: parafin, celoidin, umělé epoxidové pryskyřice Zalévání do těchto médií vyžaduje nejprve důkladné odvodnění vzorku a prosycení intermédiem (látka, která se mísí s odvodňujícím i zalévacím médiem). Teprve pak prosycujeme zalévacím médiem.

  12. Zalévání do parafínu Nejpoužívanější metoda, nevhodná ale k zalévání tuhých tkání, průkazu lipidů. Nevýhoda: smrštění tkáně při odvodnění, prosycování při vysoké teplotě Etapy: A/ odvodnění tkáně – dehydratace Vzestupná řada alkoholů - etanolu (30-50-70-80-90-96-100%) - musí být šetrné, první použitá koncentrace závisí na obsahu vody ve tkáni (např. embryonální tkáně začínají 30%, šlacha či zub i 90%, po fixaci Bouinovou tekutinou 80%, SUSA 90%) - každá lázeň několik hodin, 2x se vyměňuje, celkem 1-2 dny B/ prosycení tkáně intermédiem, projasnění benzen, xylen, toluen, metylsalicylát, metylbenzoát Intermédium musí rozpouštět parafín a mísit se se 100% alkoholem. Vysoký index lomu, provádí se ve 3 lázních po 15 minutách.

  13. C/ prosycení tekutým parafínem parafín 560C 3 lázně parafínu při 560C, 1. lázeň asi 2-4h, 2. lázeň 4-6h, 3. lázeň 8-12h, celkem cca 24 hodin. Teplota nesmí překročit 580C. D/ vlastní zalití V zalévací komůrce, používá se výhradně zkvalitněný parafín (zahřátí na 800C, přidá se 3-5% včelího vosku a přefiltruje). Bloček se přenese pinzetou, nahřátou preparační jehlou se zorientuje, nechá ztuhnout. Stále u vzorku musí zůstat značení. E/ tvrzení média Rovnoměrné tuhnutí při pokojové teplotě, úprava bločku, přitmelení na podložku. Pro rutinní zpracování histologických vzorků se používají zalévací automaty.

  14. Zalévání do celoidinu Použití: tuhé tkáně, šlachy, chrupavky, zuby, odvápněné kosti Výhoda: pokojová teplota Nevýhody: trvá dlouho, nelze použít pro lipidy, nádobky musí být dobře uzavřené Postup: - odvodnění vzestupnou řadou alkoholů - prosycení alkoholéterem - vzestupná řada celoidinu (2%,4%,8%,10%) - vlastní zalití do 10% celoidinu a tuhnutí - tvrzení bločku v 70-80% alkoholu Zalévání do želatiny Použití: řídké struktury – placenta, sliznice střeva, průkaz lipidů ad. Postup: - vyprání ve vodě - prosycení želatinou ve stoupajících koncentracích (10% a 15% vodný roztok) - vlastní zalití do 15% nebo 20% roztoku želatiny v komůrce - tvrzení v 10-20% formolu Krájení na kryostatu!

  15. Krájení řezů Krájí řezy cca 6-10 µm Sáňkový mikrotom: krájí parafín, celoidin, celodal Rotační mikrotom: parafínové bloky – zhotovení sériových řezů, např. embryologie Zmrazovací mikrotom – krájení tkání nezalitých, zalitých do želatiny

  16. Napínání a lepení parafínových řezů Řezy se napínají na vodní hladině (povrchové napětí) a lepí na podložní sklo např: směsí bílku a glycerinu 1:1 Nelze použít např. pro imunohistochemii, impregnaci. Na sklíčko se rozetře bílek s glycerinem, přenese se řez a podlije destilovanou vodou. Natažení na napínací ploténce. Označení podložního skla! Sušárna. roztokem želatiny 0,5 až 1% Řezy se podlévají želatinou, sušárna, koagulace želatiny.

  17. Světelný mikroskop Mechanická část: stativ, stolek, šrouby Optická část: objektiv, okulár Osvětlovací zařízení: světlo, kondenzor, clony Druhy objektivů: suché, imerzní Rozlišovací schopnost mikroskopu • dána jeho stavbou a optickými vlastnostmi objektivu • je vyjádřena numerickou aperturou. NA = n*sin α • n je index lomu media, α je polovina otvorového úhlu objektivu Rozlišovací schopnost je minimální vzdálenost 2 bodů, které můžeme rozlišit, mezní hodnota u světelného mikroskopu při použití šikmého osvětlení je asi 0,2μm. Přednášková prezentace je určena výhradně pro osobní studium studentů 1. LF UK.

More Related