1 / 38

Zastosowanie technik biologii molekularnej w diagnostyce hematologicznej

Zastosowanie technik biologii molekularnej w diagnostyce hematologicznej. Badania genetyczne stosowane w diagnostyce hematologicznej. bad. c ytogenetyczne klasyczne (mikroskopia ś wietlna) cytogenetyka molekularna (mikroskopia fluorescencyjna) bad. molekularne (analiza kw. nukleinowych)

chaela
Download Presentation

Zastosowanie technik biologii molekularnej w diagnostyce hematologicznej

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Zastosowanie technik biologii molekularnejw diagnostyce hematologicznej

  2. Badania genetyczne stosowane w diagnostyce hematologicznej • bad. cytogenetyczne • klasyczne (mikroskopia świetlna) • cytogenetyka molekularna (mikroskopia fluorescencyjna) • bad. molekularne(analiza kw. nukleinowych) Ograniczenia klasycznej cytogenetyki: • relatywnie niska czułość • analiza wyłącznie komórek dzielących się • znaczna pracochłonność i czasochłonność (ograniczenie liczby analizowanych mitoz)

  3. Techniki molekularne stosowane w hematologii Analiza całego genomu – wykrywaniezmian w położeniu i ilości chromosomów/genów • SKY (spectral karyotyping) • CGH (comparative genomic hybrydyzation) Poszukiwanie specyficznych zmian w genomie – konieczna uprzednia wiedza o charakterze i położeniu badanych zmian – ryzyko pominięcia innych dodatkowych zmian cytogenetycznych obecnych już na etapie diagnozy czy pojawiających się podczas leczenia • FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ) • RT-PCR • AS-PCR, PCR-RFLP • real-time PCR

  4. Diagnostyka ostrych białaczek szpikowych (AML)z typowymi aberracjami genetycznymi

  5. Swoiste aberracje chromosomowe w nowotworach układu krwiotwórczego • aberracje chromosomowe (liczbowe,strukturalne) - większość komórek nowotworowych ukł. krwiotwórczego • część aberracji – wysoce swoistadla określonych typów tych nowotworów (gł. translokacje)  charakterystyczna morfologia  odrębne cechy kliniczne Znaczenie analizy swoistych aberracji (cytogenetyka, bad. molekularne) – diagnostyka różnicowa białaczek, – czynnik prognostyczny, – wybór sposobu leczenia.

  6. Klasyfikacja WHOostrych białaczek szpikowych 1) AML z typowymi aberracjami genetycznymi • AML z t(8;21)(q22;q22), AML1/ETO M2 • AML z atypowymi eozynofilami w szpiku M4Eo inv(16)(p13;q22) lub t(16;16)(p13;q22), CBFB/MYH11 • AML promielocytowa z t(15;17)(q22;q12), PML/RARa M3 • AML w zaburzeniami 11q23, MLL M4/5 2)AML z dysplazją wieloliniową 3) AML indukowana leczeniem 4) AML wcześniej niesklasyfikowane

  7. Ostra białaczka promielocytowa (APL) 95% APL 5% APL t(15;17)(q22;q12)inne translokacje  PML (chr.15) + RARa (chr.17) PLZF (chr.11) + RARa (chr.17) NMP (chr.5) gen fuzyjny PML/RARaNUMA(chr.11) STAT5b (chr.17) transkrypt PML intron 6 (55%)  bcr1 oporność na leczenie PML exon 6 (5%)  bcr 2 kw. retinowym! PML intron4 (40%)  bcr 3  chimeryczne białko - uniemozliwia transkrypcję genów niezbędnych do dalszego różnicowania promielocytów - zmienione powinowactwo do kw.retinowego

  8. Diagnostyka APL

  9. Monitorowanie choroby resztkowej

  10. Przykładowe krzywe monitorowania wyników leczenia białaczki

  11. Choroba resztkowa Pomimoosiągnięcia całkowitej remisji (CR) worganizmie chorego może pozostawać do ok. 1010 komórek białaczkowych. Stanowią one tzw. chorobę resztkową (minimalresidual disease, MRD) i mogą byćźródłem wznowy. Choroba resztkowa – choroba nie wykrywalna konwencjonalnymi metodami cytomorfologicznym

  12. Metoda Przedmiot badania Czułość mikroskopia świetlna morfologia komórek 10-1 – 10-2 immunofenotypowanie (cytometria przepływowa, mikroskopia fluorescencyjna) antygeny: jadrowe, cytoplazmatyczne, powierzchniowe 10-2 – 10-5 cytogenetyka klasyczna aberracje chromosomowe 10-1 – 10-2 FISH aberracje chromosomowe, sekwencja DNA 10-1 – 10-4 Southern blotting rearanżacje genów TcR, Ig, translokacje swoiste dla białaczek 10-1 – 10-2 PCR (real-time, nested) rearanżacje genów TcR, Ig, translokacje swoiste dla białaczek 10-4 – 10-6

  13. Monitorowanie choroby resztkowej • polega na detekcji specyficznych markerów komórek białaczkowych • poziomy oznaczanych markerów są wyznacznikiem ilości komórek białaczkowych w organizmie pacjenta

  14. Cechy markerówstosowanych do monitorowania MRD • swoistośćdla komórek białaczkowych • obecnośćna wszystkich komórkach białaczkowych • możliwość wykrywania z dużą czułością • stabilnośćpodczas trwania choroby

  15. Rodzaje markerówstosowane do monitorowania MRD • Genetyczne • geny fuzyjne • rearanżacje genów dla receptorów kom. T TcR (, ), dla immunoglobulin (H, ) • inne • nested PCR, real-time PCR • Immunofenotypowe • zmieniona ekspresja antygenów komórek białaczkowych • cytometria przepływowa

  16. Markery genetyczne- geny fuzyjne –powstają za skutek translokacji chromosomowych,swoistych dla białaczek • bezpośredni związek z leukemogenezą – stałaobecność podczas trwania choroby • brak specyficzności dla pacjenta (możliwość wyników fałszywie dodatnich) • różna częstość występowania danych translokacji w różnych grupach pacjentów

  17. Markery genetyczne- rearanżacje genów dla TcR () i Ig (H, ) – powstają na skutek rearanżacji segmentów V, C, J tych genów • specyficzność dla klonu białaczkowego – swoistość dla pacjenta • brak stabilności podczas trwania choroby (oligoklonalność, ewolucja klonalna) – możliwość wyników fałszywie ujemnych konieczne badanie jednocześnie kilku markerów

  18. Markery genetyczne- inne – alternatywne markery przy braku genów fuzyjnych FLT3 – receptor dla kinazy tyrozynowej • udział w proliferacji, różnicowaniu i przeżywaniu kom. hematopoezy - mutacje FLT3 – najczęstsze mutacje w AML • 25% AML, 40% AML z normalny kariotpem

  19. ALL – ostra białaczka limfoblastyczna AML – ostra białaczka szpikowa CML – przewleksa biaaczka szpikowa CLL – przewlekla bialaczka limfocytowa (X)L, lymphoma - chłoniak Markery genetyczne - przykłady

  20. Markery immunofenotypowe • zmieniona ekspresja antygenów (powierzchniowych,cytoplazmatycznych, jądrowych) komórek białaczkowych LAIP - leukemia-associated aberrantimmunophenotype - krzyżowa ekspresja antygenów innych linii hematopoetycznych (np. mieloidalnych w ALL), - brak ekspresji antygenu (normalnie eksprymowanego podczas różnicowania), - nadmierna ekspresja (wyższy poziom ekspresji niż na komórkach prawidłowych lub ekspresja ag normalnie nie występujących), - asynchroniczna rozwojowo ekspresja (koekspresja antygenów, które prawidłowo pojawiają się po sobie, nie jednocześnie), - ekspresja ektopowych antygenów (obecność ag poza ich typową lokalizacją)

  21. Markery immunofenotypowe • możliwośćrozróżnienia żywych i martwych komórek • szybkość oznaczenia • brak stabilności LAIP podczas trwania choroby (zmiana typu LAIP lub nasilenia ekspresji ag danego LAIP) • znaczna heterogenność LAIP blastów u jednego pacjenta

  22. Strategia monitorowania MRD • Pierwszy pomiar poziomu MRD – na etapie diagnozy –ocena podtypu molekularnego genu fuzyjnego lub – ustalenie rodzaju LAIP i porównanie z fenotypem komórek prawidłowych – ustalenie wyjściowego poziomu MDR, który będzie stanowił wartość od nośnikową dla dalszych pomiarów • Monitorowanie kinetyki zmian poziomu MDR w czasie • Merkery genetyczne – oznaczenia poziomu transkryptów genów markerowych Poziomoznaczanych transkryptów podawany jest jakowartość znormalizowana względem genu/genów referencyjnych.

  23. Znaczenie monitorowania MRD 1) Wczesna ocena efektywności leczenia Ocena szybkość i stopnia odpowiedzi na leczenie MRD - wskaźnik chemiowrażliwości komórekbiałaczkowych 2) Podstawa do ustalenia dalszej terapii Wysoki poziom MRDwskazanie do zmianychemioterapeutyku/intensyfikacji chemioterapii. Niski poziom MRDodstąpienie od dalszej chemioterapii, uniknięcie groźnych dla życia powikłań leczeniacytostatykami. 3) Czynnik prognostyczny Poziom MRD ściśle koreluje z przeżywalnością. Pozwala na podział pacjentów na grupy o różnym ryzyku nawrotu i różnym prawdopodobieństwie długotrwałej remisji. 4) Możliwość przewidzenia nawrotu (do 6 miesięcy)

  24. Przykładowa krzywa monitorowania AML za pomocąMLL-PTD w trzech pacjentów po zastosowaniu standardowej chemioterapii.

  25. Zmiany poziomu MRD w czasie terapii wykrywane jako nieprawidłowaekspresja CD56 na CD33+CD34+ blastach w szpiku kostnym,

  26. Diagnostyka molekularnadziedzicznych postaci trombofilii

  27. Trombofilia • wrodzone lub nabyte zaburzenie mechanizmów hemostazy usposabiące do występowania zakrzepów

  28. Wrodzona trombofilia - charakterystyka kliniczna • występowanie rodzinne • występowanie w młodym wieku (poniżej 45 r.ż.) • nawroty zakrzepicy • zakrzepica w nietypowym miejscu • zakrzepica żył głębokich • zatorowść płucna • zakrzepowe zapalenie żył powierzchownych, • zakrzepica po długotrwałej podróży samolotem/samochodem • nawracające poronienia. Czynniki wyzwalające: – ciąża, połóg – zabieg operacyjny, – doustne śr. antykoncepcyjne, hormonalna terapia zastępcza – długotrwałe unieruchomienie

  29. Trombofilia wrodzona – najczęstsze przyczyny • oporność na aktywowane białko C – APC-R (1 : 20/25) • niedobór białka C (1 : 200/300) • niedobór białka S (1 : 200/300) • niedobór ATIII (1 : 3000/5000) • mutacja 20210 genu protrombiny (1 : 100)

  30. Oporność na aktywowane białko C (APC-resistance) – najczęstsza skaza osoczowa u osób z żylną chorobą zakrzepowo - zatorową  – 90% przypadków APC – mutacja Leiden • punktowa mutacja genu dla czynnika V G1691A  Arg506Gly • osłabiona hydroliza czynnika V przez aktywowane białkoC • zachowana jest czynność prozakrzepowa zwiększona produkcja trombiny

  31. Diagnostyka oporności na APC • test czynnościowy – pomiar aPTT z dodatkiem i bez ściśle określonych ilości białka C; wynik wyrażony w postaci współczynnika aPTT + APC/aPTT = współczynnik APC > 2,3 wartość prawidłowa 1,5 – 2,3 heterozygota < 1,5 homozygota  • wpływ na wynik przyjmowanych antykoagulantów (acenokumarol) • wysokie stężenie cz. VIII lub stęż. cz.V < 1% - wartości współczynnika fałszywie niskie • wartości wpółczynnika u osób z i bez mutacji mogą się pokrywać

  32. Diagnostyka oporności na APC • badanie potwierdzające – analiza mutacji Leiden • PCR-RFLP, AS-PCR

  33. Analiza mutacji Leiden za pomocą PCR-RFLP

  34. Analiza mutacji Leiden za pomocą AS-PCR

  35. Mutacja G20210A genu protrombiny – zlokalizowana w rejonie nie ulegającym translacji 3' – tranzycja GA w pozycji 20210 • nosicielstwo allelu A wiąże się z podwyższoną zawartością protrombiny w osoczu Wykrywanie: test genetyczny (PCR-RFLP)

  36. Analiza mutacji G20210A za pomocą PCR-RFLP

  37. Trombofilia wrodzona Pozytywny wynik badania molekularnego jest podstawą do: • włączenia stałej profilaktyki przeciwzakrzepowej w osób z grupy dużego ryzyka (nawroty zakrzepicy, samoistny zakrzep w nietypowym miejscu lub zagrażający życiu) • zastosowania profilaktycznego leków przeciwzakrzepowych w okresach zwiększonego ryzyka (zabieg operacyjny, długotrwałe unieruchomienie) u nosicieli.

  38. 1. Jakie technik molekularne stosuje się w hematologii do poszukiwania specyficznych zmian w genomie? 2. Jakie jest znacznie analizy specyficznych aberracji w nowotworach układu krwiotwórczego? 3. Jakie techniki molekularne stosuje się do diagnozowania ostrych białaczek szpikowych z typowymi aberracjami? 4. Co to jest ch. resztkowa i jak się ją monitoruje molekularnie? 5. Jakie jest znaczenie monitorowania ch. resztkowej? 6. Które przyczyny trombofilii wrodzonej diagnozuje się za pomocą technik molekularnych? Jakie jest znacznie takiej diagnostyki?

More Related