1 / 16

Genotypizace plodu

Genotypizace plodu. Štolba P., Masopust J. Krajská zdravotní, a.s. Masarykova nemocnice, o.z. Transfuzní oddělení. Genotypizace krevních skupin plodu. využitelné při HON genotyp lze stanovit u systémů RH (D, c, E) Kell (K) Kidd (Jk a ) Duffy (Fy a ) největší význam genotypizace RHD.

chinue
Download Presentation

Genotypizace plodu

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Genotypizaceplodu Štolba P., Masopust J. Krajská zdravotní, a.s. Masarykova nemocnice, o.z. Transfuzní oddělení

  2. Genotypizace krevních skupin plodu • využitelné při HON • genotyp lze stanovit u systémů • RH (D, c, E) • Kell (K) • Kidd (Jka) • Duffy (Fya) • největší význam genotypizace RHD

  3. Zdroje fetální DNA – rizika odběru • Invazivní a riskantní výkony • amniové fibroblasty – při amniocentéze • 0,5-1% riziko spontánních potratů, 17% riziko FMH • choriové klky • 0,5-1% riziko spontánních potratů, nízké riziko FMH • fetální krevní buňky – při kordocentéze • vyšší riziko spontánního potratu než u amniocentézy • vysoké riziko aloimunizace matky

  4. Zdroje fetální DNA – rizika odběru • Neinvazivní výkony • fetální buňky v mateřské periferní krvi • neuplatnilo se pro nevýhodný poměr mateřských a fetálních buněk • technologicky obtížné oddělení fetálních a mateřských buněk • volná (nebuněčná) fetální DNA • fetální DNA z plazmy matky • množství fet. DNA stoupá v průběhu těhotenství • abnormálně vysoké hladiny fet. DNA u patologických těhotenství

  5. Volná fetální DNA • volná fet. DNA rozptýlená v plazmě matky • koncentrace se postupně zvyšuje I. trimestr do 3 % III. trimestr až 6 % • fet. DNA po porodu rychle mizí z cirkulace • po císařském řezu za 4 – 30 min. • po vaginálním porodu za 10 – 100 hodin

  6. Odběr periferní krve matky • odebírá se min. 6 ml perif. krve matky • termíny odběru je vhodné navázat na již existující schémata – gynekologická, genetická • určení krevní skupiny matky – 12. týden • riziko nedostatečného množství fetální DNA • biochemický screening (MS AFP) – 15. - 16. týden • většinou dostačující množství fetální DNA • termín pro určení genotypu je do 18.-20. týdne

  7. Izolace volné fetální DNA • odběr periferní krve matky • do 24 hod. odstranění buněčných elementů • opakovanou centrifugací se odstraní veškeré buňky • izolace volné nebuněčné DNA • izolace doporučenou dg. soupravou / automatem • izolace veškeré volné DNA • DNA plodu tvoří cca 2 – 6 % z celkové volné DNA • izolace dostatečného množství DNA pro min. 4 PCR • okamžitá analýza vzorku / zamrazení vzorku

  8. Protokoly genotypizace RHD genu • gen RHD obsahuje 10 exonů, část sekvencí shodná s RHCE genem • více různých protokolů – detekce exonů • exony 7 a 10 – Roullilac 2007, Hromadníková 2003 • exony 4, 5 a 10 – Daniels 2004, Minon 2005, 2007 • exony 5 a 10 – Christiansen 2007 • exony 5 a 7 – Grootkerk 2006, Legler 2007 • exony 4 a 7 – Singleton 2000 • komerční kity • Devyser RHD kit (čeká na udělení CE-IVD) - exon 4

  9. Protokoly genotypizace RHD genu • doporučení testovat nejméně 2 exony (kontrola) • kombinace exonů 7 a 10 je v současnosti otestovaná k použití v ČR (doc. Hromadníková) • kombinace jiných exonů je v ČR též použitelná • u kombinace exonů 5 a 7 lze u černošské populace detekovat pseudogen RHDΨ (hlavní D-negativní alela Afričanů) • v ČR je zatím tato minorita zanedbatelná

  10. Metodika genotypizace RHD genu • amplifikace fetální DNA • metoda real-time PCR • specifické značené hydrolizační sondy • kvantitativní metoda • umožňuje odlišení mateřské a fetální DNA

  11. Taqman sondy - FRET • sonda obsahuje fluorochrom (F) a zhášeč (Q) • exonukleázová aktivita(5´3´) Taq polymerázauvolňující fluorochrom • volný fluorochrom emituje záření • záření flourochromu je zachyceno přístrojem a zpracováno

  12. čočka real-time PCR PCR v reálném čase – měření intenzity fluorescence při narůstajícím množství PCR produktu záření PCR zkumavka blok PCR cycleru vzorek

  13. RHCE a Kell genotypizace plodu • RHCE genotypizace • detekce oblasti exonu 2 (alela c) • detekce oblasti exonu 5 (alela E) • nelze vyšetřit pokud těhotná má některou z variant • Kell genotypizace • detekce SNP z exonu 6 • zatím nelze použít dříve než ve 20. týdnu (v případě malého množství fetální DNA hrozí riziko falešných negativit)

  14. Interní kontroly • interní kontroly amplifikace • amplifikační kontroly (β-globin) • kontrola fetální DNA – plod mužského pohlaví (SRY) • testování 8 polymorfismů inzercí a delecí ve vybraných lokusech – chybí v mateřské DNA • univerzální markery fetální DNA • fetální hypermetylované sekvence – gen RASSF1A • fetální hypometylované sekvence – gen SERPIN B

  15. Výhody x nevýhody vyšetření + vyšetření genotypu (RHD) plodu s použitím volné nebuněčné fet. DNA je NEINVAZIVNÍ +vysoká specificita (>99,1 %) a senzitivita (>99,5 %) vyšetření -riziko falešné negativity (i při použití fetálního markeru) - u Dw těhotných nelze určit RHD genotyp plodu -nemusí vždy souhlasit s fenotypem (mutace, přestavby genů)

  16. Děkuji za pozornost a hezký zbytek dne

More Related