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免疫组织化学

免疫组织化学. 掌握内容. 免疫组化的基本原理 免疫组化的 基本过程 免疫组化的染色技术分类 常用的免疫组化的染色原理和方法 注意事项. 免疫组织化学的基本概念 Immunohistochemistry 又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，它是用免疫学原理（特异的抗原抗体反应）来对组织内抗原（或抗体）的分布进行原位检测技术。. 1 ．发展简史 1941 年 Coons 首先用 荧光素标记抗体 — 检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功 60 年代 Nakane 建立 酶标抗体技术

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免疫组织化学

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Presentation Transcript

  1. 免疫组织化学

  2. 掌握内容 • 免疫组化的基本原理 • 免疫组化的基本过程 • 免疫组化的染色技术分类 • 常用的免疫组化的染色原理和方法 • 注意事项

  3. 免疫组织化学的基本概念 Immunohistochemistry 又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，它是用免疫学原理（特异的抗原抗体反应）来对组织内抗原（或抗体）的分布进行原位检测技术。

  4. 1．发展简史 • 1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功 • 60年代 Nakane建立酶标抗体技术 • 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。

  5. 80年代 Hsu 等建立了抗生物素的（ABC）法之后，免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 • 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展 • 2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。

  6. 免疫组织化学的优点 • 1、特异性强——免疫组化从理论上讲也是“一对一”的组织细胞中抗原的特定显示 • 2、敏感性高——抗体稀释到几千分之一、上万分之一，甚至几亿分之一时仍可在组织细胞中与抗原结合 • 3、定位准确，形态与功能相结合 • 4. 方法步骤统一——若掌握一种技术操作方法步骤，则一通百通。　　　　

  7. 免疫组织化学的基本原理 • 应用免疫学抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究

  8. 基本过程 • 抗原提取 • 制备抗体 • 抗体标记 • 制备样品 • 免疫前样品处理 • 免疫反应 • 显色反应 • 观察分析

  9. 一、提取抗原（antigen，Ag） • 生物化学各种方法提取抗原 • 一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物(抗体或抗原受体)在体内外发生特异性结合的物质。 • 基本特性：一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是反应原性

  10. 抗原（antigen ，Ag） 表位，抗原结合位点，抗原决定簇（epitope） 1 Ag 4 2 3

  11. 多克隆抗体 单克隆抗体 抗原 克隆A 表位A 表位B 克隆B 表位C 克隆C

  12. 抗体蛋白分为V区和C区， V区高度可变，是识别抗原的区域，C区是很保守的

  13. 二、制备抗体 • 即多克隆抗体（PcAb） • 单克隆抗体（McAb） • 和基因工程抗体

  14. 整体水平抗体生成技术 多克隆抗体（抗血清） 抗体的制备和选择原则：种属差异越大越好 单克隆抗体 细胞工程抗体生成技术 嵌合抗体、改形抗体 “小型化抗体”（单链抗体） 基因工程抗体生成技术 组合抗体库技术 噬菌体抗体库技术 Ig基因转基因小鼠 抗体真核表达技术

  15. 抗体的储存 新制备或购进的是原液或冻干品，抗血清为全血清，单克隆抗体是培养上清液或腹水。 1、4℃保存（6个月） 2、低温保存（-70 ℃ ～-20 ℃ ，5年） 3、真空干燥保存（5 ～ 10年） 4、稀释的抗体不能长时间保存，在 4℃可存放1~3天，超过7天效价显著降低。

  16. 抗体的储存 注意：1、保存前需经除菌 2、保存液含防腐剂（浓度低时，应加0.1%-1.5%的牛血清白蛋白作保护剂；必要时需要加0.01-0.15％NaN3防腐剂以延长保存时间；酶标记抗体不能用NaN3，会抑制酶的活性） 3、 避免反复冻融，分装（10ul或 100ul/支）

  17. 抗体稀释的配制： 常用0.01mol/L pH7.4 PBS或 TBS缓冲液 作抗体稀释液。

  18. 抗体的最佳稀度倍数：由于各种抗体的效价不同，组织中抗原强弱不一，应根据不同情况作适当的调整，以取得中等阳性稀释度为佳，因其既适合于抗原性强和含量多的标本，也可用于抗原性弱的标本。抗体的最佳稀度倍数：由于各种抗体的效价不同，组织中抗原强弱不一，应根据不同情况作适当的调整，以取得中等阳性稀释度为佳，因其既适合于抗原性强和含量多的标本，也可用于抗原性弱的标本。

  19. 三、抗体的标记物 • 荧光素——异硫氰酸荧光素（FITC）、异硫氰酸罗达明(TRITC);德克萨斯红；藻红素等 • 酶——碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等 • 金属：胶体金、胶体铁、铁蛋白等 • 亲和素、生物素、放射性同位素等

  20. 四、样品的制备 组织材料处理是获得良好免疫细胞组织化学分析的保障，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜、固定即使及时、形态保存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。 标本的主要来源：活体组织、各种体液、穿刺液、培养细胞

  21. 标本的固定与保存 好的固定剂除能满足一般组织学固定目的外，还需要： • （1）能快速固定抗原 • （2）防止抗原物质扩散 • （3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应

  22. 常用：10%福尔马林（酸性）、乙醇、丙酮、甲醛、中性缓冲多聚甲醛、戊二醛常用：10%福尔马林（酸性）、乙醇、丙酮、甲醛、中性缓冲多聚甲醛、戊二醛 • 混合固定液：Bouin液，Zamboni液、过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛（PLP）固定液

  23. 固定方法 • 细胞表面抗原——新鲜冰冻切片，后固定于丙酮 • 单层细胞、病毒、细菌——冷丙酮、冷乙醇 • 细胞悬液——先固定，然后离心制成标本 • 可溶性抗原——甲醛蒸气 • 一般组织——新鲜取材、浸泡固定

  24. 切片方法 冰冻切片 石蜡切片： • 乙醇脱水时间要短； • 浸蜡要快，温度低于60℃； • 玻片上要用黏附剂 • 蜡块尽快切片，密封保存在4℃； • 染色前彻底脱蜡 • 一般为5μm • 盖玻片、载玻片清洗干净，载玻片要涂黏附剂：明胶硫酸铬钾法、多聚赖氨酸等

  25. 五、免疫反应前的处理1、抗原修复 • 福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。 • 同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖。 • 因此，抗原修复是影响免疫组化染色结果的基本因素

  26. 抗原修复(Antigen retrieval ，AR)技术 • 抗原修复是指切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复过程。

  27. AR • 非加热技术：蛋白酶消化或酸水解 • 加热技术：微波、水浴、高压锅

  28. 酶消化(1)原理：1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白2)断交联酶消化(1)原理：1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白2)断交联

  29. 胰蛋白酶：0.05%～0.1％胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用0.1N NaOH调pH至7.8。消化时间37℃ 30min。 主要用于细胞内抗原的修复

  30. 胃蛋白酶0.4%胃蛋白酶，用0.1N HCI稀释，消化时间37℃ 30～180min。主要用于细胞间抗原的消化。此外还有蛋白酶K、链酶蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶等（细胞内抗原修复）工作中要认真参照抗体说明书指示进行消化酶的选择

  31. 修复方式：① 微波96℃±10min×2；② 直接加温100℃，15min；③ 水浴锅100℃，15min；④ 高压锅/消毒锅120℃，5min；⑤ 真空加热10min；

  32. 修复介质：①0.01M pH6.0柠檬酸缓冲液(CB)；②0.05mTris-HCL(pH1-12系列);③0.01M pH7.0 PBS;④2%硫酸铝；⑤2％硝酸铝；⑥生理盐水；⑦蒸馏水。修复介质种类和溶液的摩尔浓度对修复效果影响较小，而pH值则影响较大。缓冲液以CB和Tris-HCL较常见。

  33. 形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，而对细胞核内影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象。 热处理后自然冷却

  34. 2、冰冻切片或细胞涂片的处理 • 一般不需抗原修复 • 一般脂质细胞膜保存完整（除非用丙酮、乙醇固定） • 为了使抗体等大分子透过，需在膜上打缺口

  35. 冰冻切片或细胞涂片的处理 • 1、非离子型表面活性剂：TritonX-100等0.1%-0.5%，加入 漂洗液或抗体稀释液中使用 • 2、将固定并粘附的载玻片通过上升乙醇到二甲苯，再下降乙醇到水 • 3、反复冻融：蔗糖防冻处理，低温-70℃速冻，室温融化，反复2-3次。

  36. 免疫反应前处理——3减少非特异性着色 • 1、内源性酶或生物素：用其特异性底物或亲和物将其封闭； • 2、离子和电荷吸附：用特异性抗体来源的同种动物灭活非免疫血清，预处理。结合弱，不冲洗 • 3、一抗的稀释程度：预实验 • 4、冲洗程度：除了封闭血清不需要冲洗之外，其余每一步都需液冲洗3次～5次。常用PBS

  37. 六、免疫组织化学的主要方法 根据Ag—Ab结合方式分成： ① 直接法 ② 间接法 ③ 多层法

  38. 直接法 荧光素或酶等直接标记特异性抗体（一抗）上，标记抗体与抗原结合（在切片上） 优点：简单，时间短，特异性强。缺点：灵敏度低，所需抗体量大 （不经济），每一种抗原都需制备其标记抗体 应用：基本不用了！（免疫荧光染色法除外）

  39. 间接法 标记物标记在二抗上。显色后镜检特点：较直接法灵敏（一抗上至少可以结合两个二抗）；带标记的二抗，可定位多种抗原 常用与免疫荧光、免疫金技术

  40. 多层法

  41. 六、免疫组织化学的主要方法 按标记物的性质分成 ① 免疫荧光技术 ② 免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、 ABC法） ③ 免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）

  42. 免疫荧光技术 １.异硫氰酸荧光素 FITC ２.四乙基罗达明 ３.四甲基异硫氰酸罗达明 ４.藻红蛋白 ▲ 呈现不同的荧光： 绿色荧光 (FITC) 橙色荧光 橙红色荧光 红色荧光等

  43. 免疫荧光组织化学染色方法 1.直接法：简便、快速，用已知特异性标记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS洗。

  44. (2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，湿盒内37℃温育1h，PBS洗3×3min。(3)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗3×3min，蒸馏水洗2次，除去NaCl结晶。(4)pH9.0甘油缓冲液（磷酸盐）封片。 （必须无自发荧光，无色透明 ）(5)镜检

  45. 海马细胞 微管蛋白 绿色(胞体、树突) 轴突终末蛋白 红色(突触)

  46. 培养的成纤维细胞 微管呈绿色 核呈蓝色

  47. 2.间接法 是直接的重要改进，先用特异性一抗与组织细胞内抗原结合，随后用荧光标记二抗与一抗特异性结合。

  48. 荧光双标记技术 • 应用免疫荧光技术在同一张组织切片上同时或先后显示两种或两种以上的抗原成分，即谓双重或多重免疫标记。 • 此理论同时也可应用到其他免疫技术。如：免疫酶双重标记；免疫胶体金标记。 • 显示的水平可以是光镜，也可以是电镜

  49. 常用的荧光素配伍主要为：异硫氰酸荧光素(FITC)呈绿色与罗丹明(RB200)或异硫氰酸四甲基罗丹明（TRITC）呈红色。常用的荧光素配伍主要为：异硫氰酸荧光素(FITC)呈绿色与罗丹明(RB200)或异硫氰酸四甲基罗丹明（TRITC）呈红色。 • 技术方法敏感、特异，需选用各自特定的激发滤光片分别观察或二次曝光显影，样本不能长期保存。 • 细胞结构不清晰

  50. 免疫酶组化 + 免疫学 (抗原抗体反应) 酶细胞化学 (底物显色反应) 特异性 敏感性 定位性 可视性

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