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聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction （ PCR ）

聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction （ PCR ）. 三峡大学医学院 盛德乔 shengdq@ctgu.edu.cn. 做什么 ? 如何做 ? 如何做好？. PCR 目的. PCR 能让你体外（试管内）扩增 DNA 片段 能够扩增特异的基因 短时间内能够扩增至百万倍 必需知道部分序列！. 简 介. Polymerase chain reaction (PCR) 是由 K. Mullis 于 1985 发明的 , 这项技术通过模拟 DNA 的复制过程，在体外大量扩增目的 DNA 片段。

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聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction （ PCR ）

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Presentation Transcript

  1. 聚合酶链式反应Polymerase chain reaction （PCR） 三峡大学医学院 盛德乔 shengdq@ctgu.edu.cn

  2. 做什么? • 如何做? • 如何做好？

  3. PCR目的 • PCR 能让你体外（试管内）扩增DNA片段 • 能够扩增特异的基因 • 短时间内能够扩增至百万倍 必需知道部分序列！

  4. 简 介 Polymerase chain reaction (PCR) 是由 K. Mullis于1985发明的, 这项技术通过模拟DNA的复制过程，在体外大量扩增目的DNA片段。 PCR 技术使我们可以无限制地扩增我们研究的DNA 片段，特别是哪些不容易得到的目的DNA片段。 Kary B. Mullis The Nobel Prize in Chemistry 1993 Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350-4

  5. 模拟DNA复制过程？ DNA复制的关键 • 解链（模板） • DNA聚合酶 • 引物

  6. DNA复制 解链（模板） 加热、酸、碱 引物 人工合成 DNA聚合酶 分离、基因工程生产 合成DNA 加热变性模板 94℃ 加入引物后退火 55 ℃ 聚合酶合成（延伸）新DNA链 72 ℃ 问题？ • 聚合酶热稳定性？ • 自动、程序化处理？

  7. PCR基本原理 三步曲: 变性、退火、延伸 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。

  8. PCR的基本反应步骤 变性 95˚C 退火 Tm-5˚C 延伸 72˚C

  9. PCR体系基本组成成分 五要素 • 模板DNA Template • 特异性引物 Primer • 耐热DNA聚合酶 Taq • dNTPs • Mg2+

  10. 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液10 ml 4种dNTP混合物各200 mmol/L 引物各10～100 pmol 模板DNA 0.1～2 mg Taq DNA聚合酶2.5 u Mg2+1.5 mmol/L 加双或三蒸水至100 ul

  11. PCR仪

  12. 引物（Primer） 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。 • 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 • 实际上，有讲究！

  13. 设计引物应遵循以下原则 • 引物长度：15-30bp，常用为20 bp左右。 • 引物扩增跨度：以200-500 bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 • 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 • 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

  14. 引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 • 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。（常用！） • 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

  15. 如何设计引物？ • 手工设计 • PCR引物试剂软件 专业软件：Oligo 6，Premier Primer 半专业软件：DNAMAN, Dnasis，Omiga，Dnastar • 在线引物设计 Primer3: http://frodo.wi.mit.edu/ NCBI: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

  16. DNA序列 左边引物 右边引物 Primer3

  17. Primer3 参数设置

  18. 单击

  19. Primer3 结果输出

  20. Primer3 结果输出

  21. 选择物种 BLAST--Basic Local Alignment Search Tool 选择程序 Primer-BLAST

  22. DNA序列 引物参数

  23. 单击 • 设计引物 • 引物的特异性

  24. Taq酶 酶及其浓度　 目前有两种Taq DNA聚合酶供应： • 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶 • 另一种为大肠菌合成的基因工程酶 催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 • TaKaRa TaqTM（5 U/μl） • Invitrogen AccuPrime™ Taq DNA Polymerase

  25. 一般Taq DNA 聚合酶活性半衰期为 92.5℃ 130min 95℃ 40min 97℃ 5min • Taq DNA 聚合酶的出错率,一般PCR 中出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环 • 1.5-2 单位的Taq DNA 聚合酶就足以进行30 轮循环。所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。

  26. Taq酶特性 • 耐热性能 • 保真性能 • 是否为平末端 如何选择？

  27. Characteristics of Taq Polymerase

  28. dNTPs • dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。 • 多次冻融会使dNTP降解。

  29. 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

  30. 模 板 模板（靶基因）核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 • 蛋白质污染 • 有机试剂污染

  31. Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200mmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 • Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， • Mg2+浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

  32. PCR条件优化 • dNTPs浓度 • Mg2+浓度 • pH值 • Taq用量 • 循环中每一步时间，循环数 • 退火温度 • 加入一些辅助物: PEG、BSA、甲酰胺 • 引物设计

  33. PCR循环参数 • 预变性94~95℃/5 min • 循环（25~35） • 变性 94℃/30 Sec • 退火 52~60 ℃ / 30 Sec • 延伸 72℃/30~60 Sec • 延伸72℃/10 Min

  34. PCR扩增产物分析 • 凝胶电泳分析 （大小？） 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 • 酶切分析 • 分子杂交 ： Southern印迹杂交 斑点杂交 • 核酸序列分析

  35. PCR常见问题 • 假阴性，扩增不出特异带 • 假阳性 • 出现非特异性扩增带 • 出现片状拖带或涂抹带

  36. 提高PCR反应特异性的策略

  37. 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ Cycle 2: Annealing temperature 66 ℃ Cycle 3: Annealing temperature 64 ℃ Cycle 4: Annealing temperature 62 ℃ Cycle 1: Annealing temperature 68 ℃

  38. 提高PCR保真性的策略

  39. PCR扩增长片段DNA的策略

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