Partie II, TP-Chapitre 3 : Comment détecter qu’un individu, qui n’est pas encore en phase SIDA, soit cependant contaminé

1. Partie II, TP-Chapitre 3 : Comment détecter qu’un individu, qui n’est pas encore en phase SIDA, soit cependant contaminé par le VIH ?

2. Hypothèses ? Imaginer un protocole  I – Utilisation du test ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) (TP 4) ECE Objectif : Déterminer si un individu a été contaminé par l’antigène BSA (Bovin Serum Albumine = protéine sanguine des bovins) en cherchant la présence dans son sérum d’AC-anti BSA.

3. Matériel : - Une barrette avec 8 puits au fond desquels sont fixés des antigènes BSA. - Sérum d’un lapin que l’on sait avoir été contaminé par BSA = tube eppendorff C1 - Eau distillée = tube eppendorff C2 - Sérum du lapin à tester = tube eppendorff C3 - Solution d’AC de détection qui sont un complexe entre un AC anti-anticorps de lapin associé à une enzyme (la peroxydase) = tube eppendorff C4 - Solution contenant le substrat de l’enzyme peroxydase (TMB). TMB se transforme en un produit coloré bleu en présence de l’enzyme. = tube eppendorff C5 - Solution de lavage = erlenmeyer noté PBS tween. - Acide chlorhydrique pour stopper la réaction enzymatique : tube eppendorff C7. - 8 pipettes pasteures. - Gants et lunettes de protection - Papiers buvards. - Marqueurs. - Chronomètres. Protocole 1 ) Proposer un protocole utilisant le matériel ci-dessus permettant de déterminer si le lapin a été contaminé par BSA. Vous préciserez l’intérêt de toutes les étapes.

4. Protocole d'utilisation du matériel pour réaliser le test ELISA donné le jour de l’ECE 1 Organiser votre plan de travail pour manipuler proprement et en respectant les consignes de sécurité. = être proche de l’évier, avoir numéroter chaque pipette, avoir mis les gants et les lunettes. 2. Repérer les puits et déposer dans chacun d’eux trois gouttes ou 100 μL d’une des solutions à tester. Attention, une solution différente par puits. Ecrire SOUS le puits de façon à ce que ce soit visible en dessous et un puits sur 2 pour éviter la contamination ! Pipettage : ne pas appuyer à fond sur le réservoir sinon on aspire de l’air et on ne met pas 3 gouttes de solution mais 3 gouttes d’air avec un peu de solution !! Les niveaux doivent être identiques à la fin !!

5. 3. Ajouter dans chacun des puits trois gouttes ou 100μL de la solution d’anticorps de détection [AC2 associé à l’acétylcholinestérase]. Attention pipettage !!! 4. Laisser incuber 10 min à température ambiante. 5. Procéder au lavage : • vider le contenu de la barrette en la retournant d’un seul mouvement au-dessus de l'évier de manière à éviter le mélange des produits ; Un seul mouvement = ne pas secouer la barette !!!

6. • absorber le liquide restant en tamponnant la barrette sur du papier filtre. Préparer plusieurs feuilles AVANT et tamponner une fois, en haut, rapidement, soulever et re-tamponner en dessous pour éviter la contamination !! • laver les puits délicatement : remplir tous les puits aux trois-quarts avec la solution de lavage et vider immédiatement comme précédemment ; • vider l’eau de lavage et absorber le liquide restant en tamponnant la barrette sur du papier filtre. • renouveler ce lavage deux fois. (trois lavages en tout). 6. Ajouter dans chaque puits 6 gouttes ou 200μL de la solution d’Ellman (substrat de l’enzyme acétylcholinestérase). 7. Laisser agir 7 minutes avant de lire les résultats.

7. BSA Fond du puits Résultats 3 ) Présenter les résultats sous la forme d’un tableau comprenant les résultats de la manipulation et les schémas des associations moléculaires présentes dans les puits en fin de test en vous inspirant du schéma ci-dessous :

8. http://www.phonat.fr/charger/ElisatestV2.swf

9. Tableau des résultats du test ELISA

10. Conclusion : 4 ) Déterminer si le lapin est contaminé par BSA. Le test est positif donc le lapin est contaminé par BSA. 5 ) Proposer un protocole pour déterminer la présence de BSA dans le sérum d’un lapin. Mettre des AC anti-BSA au fond du puits. Ajouter dans 3 puits différents : eau distillée (témoin négatif), solution de BSA (témoin positif), sérum à tester. Laver (on enlève tout sauf BSA fixée) Ajouter des AC anti-BSA lié à une enzyme preoxydase. Laver (on enlève les AC non fixés) Ajouter le substrat.

11. II – Le western Blot (TP 4) Objectif : Déterminer si un individu a été contaminé par le VIH en cherchant la présence dans son sérum de protéines du VIH. Matériel : logiciel VIH Protocole : sur le bureau aller dans le dossier biolgeol, puis VIH, puis cliquer sur la 3e gélule puis sur animation. Exploitation 6 ) Expliquer brièvement le principe du western blot. On sépare par électrophorèse les antigènes du VIH et on les fixe ainsi séparés sur des bandelettes que l’on met en contact avec un sérum à tester. On révèle grâce à un AC-anticorps associé à une enzyme dont le produit est coloré.

12. 7 ) Le western blot est deux fois plus cher mais plus fiable que le test ELISA. D’après ces informations et l’animation sur le principe du western blot, expliquez pourquoi dans le diagnostic d’une contamination par le VIH, on utilise dans un premier temps un test ELISA que l’on double ensuite avec un test western blot en cas de résultat positif, pour le confirmer. WB : plus cher, plus long, plus compliqué. Donc on fait en premier ELISA. Si positif on vérifie avec WB plus fiable. 8 ) Déterminer si les patients A, B et C dont les résultats du western blot sont présentés dans la 3e gélule du logiciel VIH, sont séropositifs au VIH. C uniquement est positif car il a les bandes gp120, 160 et p24.

13. III – Utilisation du test d’Ouchterlony (TP 5) • ECE : • Plusieurs objectifs possibles le jour de l’ECE: • déterminer la présence d’antigènes ou d’anticorps dans un sérum • mettre en évidence la spécificité des anticorps vis-à-vis d’un seul antigène. • TP 5 • Objectif : Déterminer la séropositivité d’un lapin contre différents antigènes.

14. Matériel : - une plaque chauffante, une balance électronique, un bécher, une pipette + propipette permettant de mesurer 10 mL. - une coupelle, une pince en bois, un flacon d’Agar, un flacon d’eau distillée, une spatule, du papier absorbant, gants, lunettes - 2 boîtes de Pétri (6 cm de diamètre) ; un tube emporte-pièce et un cure-dent. - un marqueur (pour marquer la boîte de Pétri). - sérum du lapin (= S) à tester. - eau distillée (= E) et 4 solutions d’antigènes protéiques : pancréatine= P ; caséine= C ; hémoglobine= H ; albumine de sérum de bœuf (BSA)=B - une pipette pasteur pour chaque produit, un chronomètre ; une lampe de bureau et une petite feuille de papier noir.

15. Protocole I-Préparation d’un gel d’agar (= gélose) à couler dans une boite de Pétri pour test d’Ouchterlony 1. organiser votre plan de travail pour manipuler proprement et en suivant les consignes de sécurité ; = rien autour du réchaud qu’on allume quand on en a besoin et on éteint dès qu’on a fini. = lunettes quand on fait chauffer (pas les gants, risques de brûlures !) = gants + lunettes quand on manipule les solutions. 2. peser dans la coupelle 0,2 g d’agar prélevés à l’aide de la spatule ; Ne pas oublier de faire la tare avec la coupelle vide…

16. 3. verser 14 mL d’eau distillée puis l’agar dans le bécher et mélanger soigneusement l’agar avec la spatule ; 4. chauffer le mélange en remuant à la spatule jusqu’à ce que le mélange devienne limpide et arrêter 20 à 30s après le début de l’ébullition ; Tenir le bécher avec la pince pour pouvoir le retirer rapidement si nécessaire. 5. retirer à l’aide de la pince en bois, attendre quelques secondes que le bécher refroidisse afin de pouvoir le saisir sans se brûler ; Ne pas trop attendre sinon l’agar se solidifie dans le bécher ! 6. utiliser le bécher pour vider environ 1/3 d’agar chaud dans la boite de Pétri, soit une hauteur d’un ½ cm ; 7. égaliser le niveau et supprimer rapidement les bulles ; Utiliser le cure dent pour les bulles

17. 8. laisser la boite refroidir sans mettre le couvercle ; 9. ne pas remuer la boîte avant prise du gel d’agar : au moins 5 mn. 2 ) Après lecture du principe du test (voir protocole), déterminer où placer les solutions dans chaque puits afin de déterminer pour quels antigènes il est séropositif. E = témoin négatif E P B S H C

18. 4 ) Représenter les résultats obtenus sur le schéma ci-dessous. Arc de précipitation S = sérum à tester E = eau distillée P = pancréatine C = caséine H = hémoglobine B = albumine de sérum de bœuf E P B S Titre : représentation des résultats H C

19. 5 ) Réaliser ensuite, en utilisant le modèle d’anticorps ci-dessous et d’autres symboles à votre convenance, deux schémas qui expliquent au niveau moléculaire la présence ou l’absence d’un arc de précipitation. B Diffusion des AC Diffusion des antigènes BSA S Complexe immun = arc de précipitation Titre : schéma expliquant l’apparition de l’arc de précipitation

20. Titre : schéma expliquant l’absence d’arc de précipitation P Diffusion des AC Diffusion des antigènes P S Absence de complexe immun = pas d’arc de précipitation

21. Conclusion : 6 ) Déterminer contre quels antigènes le lapin est séropositif. Arc de précipitation uniquement entre le sérum et le puits B donc complexe immun donc anticorps anti-BSA présents donc séropositif contre BSA.

22. Pour poursuivre la réflexion 8 ) Proposer un protocole utilisant le test d’Ouchterlony, pour déterminer qu’un anticorps anti-BSA est spécifique de son antigène. Idem sauf qu’au centre on met des AC anti-BSA S = sérum contenant AC anti-BSA E = eau distillée P = pancréatine C = caséine H = hémoglobine B = albumine de sérum de bœuf E P B S H C