免疫共沉淀技术验证蛋白质相互作用 的研究

1. 免疫共沉淀技术验证蛋白质相互作用的研究 翟华立 2013-7-25

2. 目录 免疫共沉淀技术原理 hCLP46与calnexin相互作用研究背景 hCLP46与calnexin相互作用研究方法 结果分析 讨论与展望

3. 免疫共沉淀技术原理 Co-Immunoprecipitation(CO-IP) • a classical method used for research protein-protein interaction on the basis of specificity of antibody to antigen. • an effective method to confirm two kinds of proteins endogenous interaction in cell. • It utilizes antibody to precipitate the corresponding specific molecule meanwhile the other molecules with specific binding to the molecule will be precipitated. • be used to validate proteins specific binding.

4. 免疫共沉淀技术原理 • 基本原理是：在非变性条件下，将细胞裂解，细胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析.

5. 免疫共沉淀技术原理图解

6. hCLP46与calnexin相互作用研究背景 细胞中DNA复制和转录、蛋白质的翻译、剪切 和分泌、细胞周期的调控、信号传导途径和中间 代谢等都受到蛋白质相互作用的调控，因此，研 究蛋白质的相互作用具有十分重要的意义。 以往的CO-IP研究主要是蛋白质紧密结合的相互 作用，对于短暂的或较弱的相互作用研究较少。 通过研究hCLP46与calnexin的相互作用，为开展蛋白质弱的相互作用的验证提供参考。

7. hCLP46与calnexin相互作用研究方法 细胞培养 Step 1 Step 2 CO-IP 预实验 方法 Western Blotting检测 CO-IP 实验 Step 4 Step 3 通过对免疫共沉淀不同影响因素的优化探究最佳的较弱蛋白质相互作用的实验条件

8. CO-IP预实验 对细胞裂解液中各成分浓度、抗体用量及抗体的结合 时间、hCLP46蛋白的量以及交联剂DSP等影响因素 进行调整和改进。 Co-IP的基本步骤 4. 离心，电泳 Western Blottimg 检测蛋白质相互作用。 • 收集细胞， • 用磷酸缓冲液 • 清洗。 2. 细胞裂解液 冰上裂解，离 心，收集上清 液，加标签抗 体混合旋转。 3. 加Protein G混合，加 SDS煮沸处理。

9. CO-IP操作步骤

10. CO-IP实验 用预冷并添加0.1mmol/LCaCl2和MgCl2的磷酸缓冲液洗涤细胞3次，弃磷酸缓冲液后加入交联剂DSP1mmol/L,冰浴2h,每隔20min轻晃细胞培养皿。 弃DSP后，加入20mmol/L pH7.4Tris-HCl,冰浴15min以终止DSP反应。 磷酸缓冲溶液洗涤细胞3次，每皿800μL预冷的细胞裂解液，冰上裂解30min. 4℃,2500r/min离心5min，不含PMSF的细胞裂解液洗涤beads3次，每次1mL。加入SDS煮沸10min,离心后电泳。 4℃,13500r/min离心20min。上清液转移至新离心管，加入3.6μg Myc抗体， 4℃混合旋转2h。 再加入预清洗的30 μL Protein G breads, 4℃混合旋转2h。孵育后4℃静置30min。

11. Western Blotting检测calnexin与hCLP46的相互作用

12. Western Blotting检测calnexin与hCLP46的相互作用 • 用12%SDS-PAGE胶对蛋白样品进行电泳，每孔上样20μL。分离后，200mA电转至PVDF膜,上。含5%脱脂奶粉的TBST(20mmol/L Tris pH7.6,150mmol/LNaCl,0.1% tween-20)室温封, 闭PVDF膜1h。含3%脱脂奶粉的TBST按1:2000, 稀释Myc抗体，按1:100稀释calnexin抗体。 • 4℃杂交过夜。TBST洗膜3次，每次10min,含 5%脱脂奶粉的TBST按1:2000稀释偶联HRP的二抗，室温杂交1h • TBST洗膜3次，每次10min，TBST再洗膜3次，每次5min,Millipore 发光液按1:1混合，滴在膜上显色10s,暗室曝光。

13. 结果分析 • 裂解液中各成分浓度对免疫共沉淀的影响 • 1: hCLP46 input; 2: calnexin input; 3: IP anti-Myc 沉淀 未检测到沉淀中存在calnexin． • Fig.1 Damage of high concentrations of salt and partial alkaline environment to interaction between hCLP46 and calnexin

14. 结果分析 • 抗体用量对免疫共沉淀的影响 • 1: hCLP46 input; 2: calnexin input; 3: IP control，293Trex 细胞做对照; 4: IP anti-Myc 沉淀，未检测到沉淀中存在calnexin． • Fig.2 No interaction between hCLP46 andcalnexin with low concentration of antibodies

15. 结果分析 • 抗体用量对免疫共沉淀的影响 • 1: hCLP46 input; 2: calnexin input; 3: IP control，293Trex 细胞做对照; 4: IP anti-Myc 沉淀，检测到沉淀中存在calnexin． • Fig.3 Interaction between hCLP46 andcalnexin after exalting the dosage of antibody

16. 结果分析 • hCLP蛋白量对免疫共沉淀的影响 • 1: hCLP46 input; 2: calnexin input; 3: IP anti-Myc 沉淀，检测到沉淀中存在hCLP46; 4: IP anti-Myc 沉淀，未检测到沉淀中存在calnexin • Fig.4 Damage of too high hCLP46 expression tointeraction between hCLP46 and calnexin

17. 结果分析 • 交联剂DSP对免疫共沉淀的影响 • 1: hCLP46 input; 2: calnexin input; 3: IP anti-Myc 沉淀，检测到沉淀中存在hCLP46; 4: IP control，293Trex 细胞做对照; 5: IP anti-Myc 沉淀，检测到沉淀中存在calnexin． • Fig.5 Interaction between hCLP46 andcalnexin stabilized by cross link reagent DSP

18. 结果分析 • 采用优化和筛选后的最佳免疫共沉淀条件，得到了hCLP46 蛋白和calnexin 的相互作用。 • 1: hCLP46 input; 2: calnexin input; 3: IP control，293Trex 细胞做对照; 4: IP anti-Myc 沉淀，检测到沉淀中存在calnexin． • Fig.6 Interaction between hCLP46 and calnexinwith best conditions of co-immunoprecipitation

19. 讨论与展望 • 高浓度的盐离子和偏碱性的微环境会破坏hCLP46和calnexin的相互作用。Nacl的浓度由150mmol/L降至100mmol/L，PH由8.0降至6.8，NP40由1%降至0.5%。 • 增加抗体用量、减少hCLP46蛋白量。抗体用量采用0.48X10-2 μg / μL，四环素用量由1 μg / mL降至0.5 μg / mL。 • 使用交联剂DSP稳定hCLP46和calnexin的相互作用，在后续洗脱的极端条件下使得hCLP46-calnexin蛋白复合体不会发生解聚。 讨论

20. 讨论与展望 注意事项 1.细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用。 2. 最需要注意点是抗体的性质，特别是多抗的特异性是问题。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。 3. 低温下进行实验。为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂。 4. 考虑抗体/缓冲液的比例。（抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释） 5. 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的。

21. 讨论与展望 • 通过条件的优化和筛选得到hCLP46与calnexin 相互作用的适宜条件，二者的相互作用需要温和 的细胞裂解条件、中性的环境、二者的蛋白表达 量保持相当、交联剂DSP的稳定。 • 通过对hCLP46与calnexin蛋白相互作用的Co-Ip 影响因素的研究探讨，为研究蛋白质的相互作用提供了参考。

22. 讨论与展望 应用实例： • Development of a Flow Cytometric Co-Immunoprecipitation Technique for the Study of Multiple Protein—Protein Interactions and Its Application to T-Cell Receptor Analysis • Identification of protein complexes from co-immunoprecipitation data • Microsphere-based co-immunoprecipitation in multiplex • Verificafion of the Interaction between SET and eEFl Al in Hnlnan Liver Cells by Co-immunoprecipitation • Determining the Target Genes of RIN Transcription Factor by Chromatin Immunoprecipitation • Screening of HMGB4 interacting Proteins Using Co-immunoprecipitation Technology and Mass Spectrometric Analysis

23. 讨论及展望 应用前景： 1.寻找新的相互作用蛋白 2.验证目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用 3.优化免疫共沉淀的实验条件，探究更多的蛋白质 弱的相互作用。 4.与其他验证蛋白质相互作用的新技术联用，研究 具有重要意义的蛋白质短暂的、弱的相互作用。

24. Thank You !