Le Métabolisme de l’Oxygène et le Rôle du Stress Oxydant en Pathologie

1. 2011-2012 MED2Pr N. Porchet Enseignement Thématique « Bases Moléculaires et Cellulaires des Pathologies » Séminaire : Les interactions métabolisme/signalisation génétique, au travers d’exemples Le Métabolisme de l’Oxygène et le Rôle du Stress Oxydant en Pathologie • OBJECTIFS ET PREREQUIS • Présenter les bases moléculaires du métabolisme de l’oxygène dans la mitochondrie • Comme suite du cours « La cellule, carrefour du métabolisme » (à connaître) et avec, comme prérequis, le cours du Pr Ph Marchetti (PACES, mitochondrie) • La bioénergétique mitochondriale sera complétée dans le cadre du cours sur le métabolisme glucidique (EI Endocrinologie-Hormonologie-Reproduction) • Illustrer la notion d’homéostasie métabolique et les conséquences pathologiques multiples de la survenue d’un déséquilibre « oxygène réactif-antioxydants » : comment l’oxygène peut-il être toxique ? • Champ des connaissances médicales générales sur le vieillissement, les maladies neurodégénératives, l’athérosclérose, le diabète…….

2. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Rôle du Stress Oxydant en Pathologie • I- DEFINITIONS, PLAN DU COURS • ● L’oxygène est, chez les espèces vivantes aérobies, indispensable à la production d’énergie • ● Son métabolisme siège dans la mitochondrie • ● La bioénergétiquemitochondriale fabrique de l’ATP par phosphorylation oxydative grâce à une chaîne de transport d’électrons et de protons • = chaîne respiratoire • ● Le métabolisme principal de l’oxygène se conclue en une réduction tétravalente de l’oxygène avec production d’eau et synthèse d’ATP : • 02 + 4 e- + 4 H+→ 2 H2O + énergie • ● Cependant, une faible quantité de l’oxygène partiellement réduit peut s’échapper de la chaîne respiratoire : espèces chimiques très réactives : ERO.

3. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant • I- DEFINITIONS, PLAN DU COURS • ● Les espèces radicalaires ( appelées aussi radicaux libres) de l’oxygène (appartenant aux ERO) ont longtemps été considérées comme des sous-produits toxiques du métabolisme normal de l’oxygène • ● Les ERO sont également impliqués dans les mécanismes de la signalisation cellulaire et participent au maintien de l’homéostasie cellulaire • ● Stress oxydant (ou oxydatif) : déséquilibre entre la production d’espèces réactives de l’oxygène et les capacités cellulaires anti-oxydantes • ● Les ERO sont capables d’altérer de nombreux types de biomolécules • (lipides, protéines, acides nucléiques, sucres) • ● Les ERO sont impliqués dans la physiopathologie de nombreuses pathologies

4. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant II- METABOLISME DE L’OXYGENE : 1/ Le métabolisme aérobie A- L’oxygèneOxygène (= dioxygène), O2 - L’atmosphère terrestre s’est enrichie en oxygène il y a 2 milliards d’années - L’oxygène est devenu indispensable à la vie de la plupart des espèces vivant sur Terre : animaux, plantes, bactéries Ref 1

5. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant II- METABOLISME DE L’OXYGENE : 1/ Le métabolisme aérobie B- Les espèces aérobies - Espèces vivantes qui ont développé progressivement des mécanismes leur permettant d’utiliser l’oxygène comme source d’énergie : Des chaînes primitives de transport d’électrons se sont progressivement adaptées au transport d’électrons depuis le NADPH vers l’O2 Forteconservation des structures au cours de l’Evolution : La conformation du cytochrome c est restée constante pendant plus d’un milliard d’années Ref 1

6. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant C- L’oxydation de l’hydrogène hydrogène + oxygène → eau + énergie ●L’oxygène apporté par l’hémoglobine aux cellules est l’accepteur final des électrons de l’hydrogène ●Ces électrons proviennent du catabolisme des nutriments (AA, AG, glucose) ● La combustion libèrerait l’énergie instantanément (A) et sous forme de chaleur (mécanisme incompatible avec la vie) ● L’oxydation biologique (B) sépare l’hydrogène en protons (H+) et électrons (e-) : 2 H+ + 2 e- ● Elle permet de réaliser une chaîne de transport de protons et d’électrons jusqu’à l’oxygène et le stockage de leur énergie sous forme chimique (ATP) Ref 2 Ref 1

7. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant II- METABOLISME DE L’OXYGENE C- L’oxydation de l’hydrogène ● Les atomes d’hydrogène proviennent du catabolisme des substrats carbonés ● Ils sont transférés au cours de ces réactions enzymatiques à des coenzymes qui passent de l’état oxydé à l’état réduit : Nicotinamide Adénine Dinucléotide (NADH, H+) Flavine Adénine Dinucléotide (FADH2) ● les coenzymes réduits deviennent les substrats de cette chaîne de transport = la chaîne respiratoire Ref 3

8. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant II- METABOLISME DE L’OXYGENE D- Les coenzymes : des couples oxydo-réducteurs ● NAD/NADH, NADP/NADPH et FAD/FADH2 :molécules permettant les réactions métaboliques d’oxydation et de réduction des substrats Ex : biosynthèse du cholestérol Ref 1

9. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant D- Les coenzymes : couples oxydo-réducteurs ● NADH, NADPH et FADH2 :molécules « riches en énergie » car possèdent une paire d’électrons à haut potentiel de transfert 1/ capture d électrons 2/ don d’électrons Ref 2 Ref 1

10. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant E- La mitochondrie Ref 3 mitochondrie ● les coenzymes réduits sont formés majoritairement dans les mitochondries ● les coenzymes oxydés formés dans le cytoplasme rejoignent la mitochondrie grâce à des navettes ● la mitochondrie est une micro-usine chimique spécialisée dans les réactions d’oxydo-réduction (quelques milliers de mitochondries par cellule) ● la zone de travail chimique est essentiellement représentée par la matrice et la membrane interne ● 500 l d’oxygène sont absorbés par l’homme chaque jour dont 90% sont utilisés dans les mitochondries pour des réactions d’oxydo-réduction : respiration cellulaire

11. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant F- La chaîne respiratoire mitochondriale ► = Outil permettant le transfert de protons et d’électrons 1/ Produit de l’eau coenzymes réduits → hydrogène respiration → oxygène 2/ Stocke l’énergie libérée : synthèse d’ATP par phosphorylation de l’ADP ► la chaîne d’oxydo-réduction = 6 complexes moléculaires matrice membrane interne Ref 1 4 complexes fixes (membrane interne mitochondriale) : Complexes I, II, III, IV 2 complexes mobiles (solubles) : Ubiquinone ou coenzyme Q Cytochrome c Ref 3

12. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant G- Les composants de la chaîne respiratoire = systèmes rédox capables de recevoir puis céder 1/ des électrons 2/ des protons Mais aussi de les guider de complexe en complexe, sans rupture du flux selon une succession précise de réactions exergoniques Les protons sont expulsés vers l’espace inter-membranaire par des pompes à protons ~ 40 protéines, cytochromes, complexes fer-soufre, ions cuivre, flavoprotéines Ref 3 En fin de chaîne, la cytochrome c oxydase catalyse la réduction de l’oxygène moléculaire en eau (500l/j) :

13. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant H- Le couplage de la réoxydation des coenzymes et de la production d’ATP les électrons atteignent leur but : l’oxygène leur énergie a permis la formation d’un gradient électrochimique de protons Ces protons vont permettre d’activer l’ATP synthase circuit du gradient de protons = gradient de voltage + gradient de pH Ref 1 Ref 3 Volumineux complexe de protéines formé de 2 sous-ensembles : F0 intramembranaire : canal à protons F1 dans la matrice : phosphoryle l’ADP

14. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant H- la production d’ATP : résumé 1/ trajet des électrons et des protons le long de la chaîne respiratoire 2/ réduction de l’oxygène en eau ATP synthase appelée complexe V 3/ synthèse d’ATP Ref 1 Ref 3

15. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant I- Régulation des oxydations phosphorylantes et de la production d’ATP ● Il existe une coordination entre production et consommation d’ATP - très peu d’ATP, ADP libres : fonctionnement « à flux tendu » - si le gradient de protons n’est pas utilisé par l’ATP synthase, le transport d’électrons s’arrête - l’ATP synthase est capable d’hydrolyser l’ATP s’il est en excès (activité ATPasique) ● Il existe une régulation spécifique à chaque type cellulaire ● Il existe un couplage des mécanismes 1/de transport des électrons et 2/ d’oxydations phosphorylantes (= simultanéité) dans la plupart des cellules ● Il existe un découplage dans certains tissus (tissu adipeux brun), ce qui permet de produire de la chaleur (animaux en hibernation, enfants nouveaux-nés)

16. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant II- METABOLISME DE L’OXYGENE 1- Le métabolisme aérobie J- Dynamique du réseau mitochondrial ● Les mitochondries sont assemblées en un réseau superposable à celui du réticulum endoplasmique ● L’organisation de ce réseau est corrélée au niveau de production énergétique et aux besoins de la cellule ● Le réseau peut être fractionné (phase S) ou fusionné (phase G1), en fonction des besoins énergétiques tout au long de la vie cellulaire Ref 3

17. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant II- METABOLISME DE L’OXYGENE 2- Le « 2ème métabolisme » de l’oxygène A- Les espèces réactives de l’oxygène ● Lors du métabolisme normal de l’oxygène= réduction tétravalente de l’oxygène, Il se forme, au cours des 4 étapes électroniques, une petite quantité d’intermédiaires partiellement réduits, appelés radicaux primaires qui appartiennent à un ensemble appelé : ERO = Espèces Réactives de l’OxygèneROS = Reactive Oxygen Species) Ces entités peuvent être radicalaires ou moléculaires et sont beaucoup plus réactives que l’oxygène ● Les ERO radicalaires (= radicaux libres) sont des espèces chimiques possédant 1 électron célibataire sur leur couche périphérique ce qui leur confère un fort degré de réactivité

18. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant 2- Le « 2ème métabolisme » de l’oxygène Ref 5 B- Diversité des ERO : molécules et radicaux libres ● Les ERO sont des espèces moléculaires : ex: le peroxyde d’hydrogène H202 radicalaires : ex : l’anion superoxyde : O●- ex : leradical hydroxyle :●OH Ref 5 ● Les ERO primaires sont : - l’anion superoxyde - le peroxyde d’hydrogène - le radical hydroxyle ● Les ERO secondaires sont ceux qui se forment par oxydation de biomolécules : - le radical peroxyle - l’hydroperoxyde - le radical alkoxyle

19. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant 2- Le « 2ème métabolisme » de l’oxygène C- Anabolisme des ERO primaires Les 4 étapes de réduction monoélectronique de l’oxygène Ref 5 ●L’anion superoxyde(1): O●- provient d’une réduction partielle de l’oxygène dans la chaîne respiratoire (~ 2% de l’oxygène consommé par la mitochondrie), il se forme durant la 1ère réduction électronique de l’oxygène au niveau de l’ubiquinone (coenzyme Q)

20. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant 2- Le « 2ème métabolisme » de l’oxygène C- Anabolisme des ERO primaires ●L’anion superoxyde(1): O●- est également le produit de certaines activités enzymatiques : NADH déshydrogénase (membrane mitochondriale interne) NAD(P)H oxydases membranaires (NOX) (cellules vasculaires et endothéliales, cytoplasme) Auto-oxydation (oxydation par l’oxygène) de biomolécules endogènes noyau aromatique (adrénaline, noradrénaline, dopamine), thiols (cystéine), coenzymes réduits à flavine Oxydation de xénobiotiques par les cytochromes P450 (réticulum endoplasmique)

21. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant 2- Le « 2ème métabolisme » de l’oxygène C- Anabolisme des ERO primaires Ref 5 ●Le peroxyde d’hydrogène (2): est produit dans les mitochondries mais aussi dans les peroxysomes et le cytoplasme au cours de différentes réactions enzymatiques : SOD : superoxyde dismutases : OXYDASES : AA oxydases, glycolate oxydase, urate oxydase, xanthine oxydase

22. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant 2- Le « 2ème métabolisme » de l’oxygène C- Anabolisme des ERO primaires Ref 5 ●Le radical hydroxyle (3): est produit quand le peroxyde d’hydrogène entre en contact dans des conditions de pH acide favorables avec des ions ferreux : Le radical hydroxyle (différent de l’anion basique –OH) est très toxique : c’est l’un des oxydants naturels les plus puissants (utilisé dans l’industrie)

23. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant II- METABOLISME DE L’OXYGENE 2- Le « 2ème métabolisme » de l’oxygène D- Anabolisme des ERO secondaires Le radical hydroxyle ●OH génère l’espèce réactive R● ● oxydant puissant selon 3 mécanismes : Ref 5

24. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant II- METABOLISME DE L’OXYGENE 2- Le « 2ème métabolisme » de l’oxygène D- Anabolisme des ERO secondaires ●L’espèce réactive R● oxyde d’autres biomolécules : des réactions d’oxydation en chaîne ● Les espèces réactives de l’oxygène interagissent entre elles peroxynitrites

25. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant 2- Le « 2ème métabolisme » de l’oxygène E- Effets délétères des ERO au niveau moléculaire L’espèce la plus réactive et la plus toxique : le radical hydroxyle :●OH ●est le plus dommageable en raison de son extrême réactivité ●aussi sa ½ vie est très brève (<1μs) et ses effets délétères se manifestent sur son lieu de production ●s’attaque à toutes les biomolécules impliquées dans 1/ les structures biologiques (ex: membranes), 2/ l’information 3/ le métabolisme ● biomolécules-cibles :ADN mitochondrial ou nucléaire, protéines, lipides, sucres Lésions de l’ADN, coupures et mort cellulaire, altération des bases Altérations des protéines, AA aromatiques, soufrés….sites enzymatiques…. oxydation des sucres : glucose surtout la guanine Peroxydation lipidique : acides gras polyinsaturés, phospholipides, lipoprotéines R1 R2

26. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant II- METABOLISME DE L’OXYGENE 2- Le « 2ème métabolisme » de l’oxygène E- Effets délétères des ERO au niveau moléculaire Une espèce peu réactive : l’anion superoxyde : O●- ● une ½ vie longue (qq dizaines de s) qui lui permet de diffuser hors de son site de production ● sa toxicité est indirecte et vient de sa capacité à interagir avec d’autres ERO pour former des ERO à toxicité forte : radical hydroxyle, peroxynitrites

27. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant 2- Le « 2ème métabolisme » de l’oxygène F- les systèmes de défense enzymatiques anti-oxydants ● Les SOD (superoxyde dismutases) catabolisent l’anion superoxyde Plusieurs enzymes ayant comme cofacteur : Mn (mitochondries) : Mn -SOD Cu et Zn (cytosol) : Cu,Zn-SOD Ref 5 1/ Mox : SOD sous forme oxydée Mred : SOD sous forme réduite 2/ Ref 4

28. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant 2- le « 2ème métabolisme » de l’oxygène F- les systèmes de défense enzymatiques anti-oxydants ● La catalase et les glutathion peroxydases Catalase(4)(peroxysomes) Ref 5 Glutathion peroxydases (4) (cytosol de nb types cellulaires) Ref 6

29. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant 2- Le « 2ème métabolisme » de l’oxygène G- les systèmes de défense non enzymatiques : capteurs d’ERO ● Vitamines : C (acide ascorbique), E (αtocophérol), A (β carotène) ● Oligoéléments : Se, Cu, Zn ● Composés à groupement thiol (-SH) ● Polyphénols (acide caféique, quercétine, flavonoïdes…..) Importance de l’apport alimentaire : fruits, légumes, thé, vin rouge ● Trop d’anti-oxydants = pro-oxydants : néfaste

30. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant 2- Le « 2ème métabolisme » de l’oxygène 1/1 H- Le stress oxydant intoxications aux métaux lourds (Hg, Pb, Cd) irradiations (UV, rayons X), infections, SIDA, carences nutrition-nelles, alcoolisme, médicaments (anthracyclines), ozone, polluants… ● Etat métabolique résultant de la perte de l’homéostasie du métabolisme de l’oxygène : balance rédox déséquilibrée ● Causes multiples de la rupture d’homéostasie 1/ production excessive d’ERO - 1/1 stress d’origine exogène - 1/2 stress d’origine endogène 2/ production excessive et durable d’ERO et réponse anti-oxydante insuffisante 3/ diminution des capacités anti-oxydantes maladies génétiques du métabolisme de l’oxygène, vieillissement, ischémies,athérosclérose, maladies neuro-dégénératives, diabète pathologies articulaires..… anti-oxydants 1/2 ERO 2 cancer 3 obésité, tabagisme, emphysème pulmonaire

31. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant 2- Le « 2ème métabolisme » de l’oxygène anti-oxydants I- Le stress oxydant : un rôle biologique ? ERO Une simple imperfection de la chaîne respiratoire? ● NON, un rôle biologique : trop d’anti-oxydants = pro-oxydants : néfaste Régulation génique : activateurs/régulateurs de voies de signalisation rôle de transduction et d’amplification de signaux ; régulation de phosphatases et de kinases Ex : Régulation du tonus vasculaire, relaxation du muscle lisse, adhésion plaquettaire Régulation de fonctions générales : apoptose, cycle cellulaire, prolifération cellulaire Réponse et résistance au stress : réponse immunitaire, inflammation, phagocytose, exercice physique intensif……. Ex : Défense anti-microbienne : une explosion oxydative pour détruire le pathogène

32. Le Métabolisme de l’Oxygène et le Stress Oxydant • III- REFERENCES • Les illustrations citées en référence proviennent des livres de biochimie suivants, dont la lecture est recommandée : • Ref 3 Chimie, biochimie et biologie moléculaire OMNISCIENCES Collège national des enseignants des facultés de médecine sous la direction de Bernard Sablonnière • Ref 6 Biochimie illustrée MALOINE P N Campbell, A D Smith ● Ref 2 Biochimie Humaine MEDECINE-SCIENCES, FLAMMARION F Horn, G Lindenmeier, C Grillhösl, I Moc, S Gerghold, N Schneider, B Münster ● Ref 1 Biologie Moléculaire de la Cellule MEDECINE-SCIENCES, FLAMMARION B Alberts, A Johnson, J Lewis, M Raff, K Roberts, P Walter ● Ref 4 Biochimie MEDECINE-SCIENCES, FLAMMARION L Stryer, JM Berg, JL Tymoczko Autres sources : Revue m/s médecine/sciences ● Ref 5 Espèces Réactives de l’oxygène et stress oxydant C Migdal et M Serres, vol 27, avril 2011 L’actualité chimique • Ref 7 Espèces réactives de l’oxygène : Comment l’oxygène peut-il devenir toxique? M Gardès-Albert, D Bonnefont-Rousselot, Z Abedinzadeh, D Jore, 2003