BIOKATALIZA

1. BIOKATALIZA

2. Biokataliza se u hemijskoj industriji primenjuje, kako za proizvodnju specifičnih proizvoda, tako i za tretman otpada. Imajući u vidu da su enzimi proteinski molekuli, koji odgovaraju koloidima, enzimska kataliza se može svrstati između homogene i heterogene katalize. Često enzimski molekuli sadrže aktivne metalne centre po čemu podsećaju na organo-metalne komplekse u homogenoj katalizi. Razlika je u tome, što su u slučaju enzima, ligandi proteinski makromolekuli, pa se oni karakterišu znatno većim molekulskim masama.

3. Enzimi su katalizatori sa visokom aktivnošću i selektivnošću. Efikasnost enzima u poređenju sa klasičnim homogenim i heterogenim hemijskim katalizatorima je 105-107 puta veća. Osim visoke aktivnosti i selektivnosti, koja pored hemijske podrazumeva regio- i enantio selektivnost, glavna prednost enzima je u tome što oni deluju na niskim temperaturama, u vodenim rastvorima i na pH oko 7. Budući da enzimi deluju u blagim uslovima, utrošci energije su mali.

4. Zbog visoke aktivnosti i selektivnosti enzimski procesi se odvijaju brzo, željeni proizvod se dobija u visokom prinosu jer nema sporednih reakcija koje rezultuju stvaranjem nepotrebnih proizvoda ili otpada, pa se može reći da biokataliza ispunjava sve principe zelene hemije. Jedan izolovani enzim, obično vrši jednu transformaciju na supstratu, međutim multienzimski kompleksi složene strukture, kao i cele ćelije koje sadrže više enzima deluju kao bi- ili polifunkcionalni katalizatori, tj. omogućavaju da se tokom nekog složenog procesa, jedna za drugom odigrava veći broj transformacija.

5. Razvoj biotehnologije, odnosno biokatalize je u velikoj meri doprineo uvođenju biomase kao obnovljive sirovine u hemijskoj industriji. Naime, složena struktura biomase koja podrazumeva prisustvo velikog broja reaktivnih funkcionalnih grupa čini njihovu primenu kao sirovine u klasičnim hemijskim postupcima komplikovanom, pa se efikasna i selektivna konverzija prirodnih proizvoda obično može odigrati samo u prisustvu enzima, kao prirodnih katalizatora. Treba, takođe imati u vidu da upotreba biomase kao sirovine u industriji ne zahteva isključivo primenu biokatalize, kao i da postoji relativno veliki broj komercijalnih biotehnoloških procesa u kojima se prerađuju sirovine koje ne potiču od biomase.

6. Glavni razlozi koji ograničavaju širu primenu biokatalize u industriji, a odnose se na većinu enzima, su: - njihova mala stabilnost u uslovima različitim od fizioloških, - delovanje samo pri niskim koncentracijama supstrata, - teškoće pri regeneraciji, i - visoka cena. Iz navedenih razloga od približno 4000 poznatih enzima, od kojih je oko 400 komercijalno dostupno, svega četrdesetak enzima se trenutno koristi u industrijskim procesima. U enzimski katalizovanim reakcijama u industriji koriste se cele ćelije, ekstrakti ćelija ili izolovani enzimi. U cilju smanjenja troškova i lakše regeneracije, cele ćelije ili enzimi se, kao i klasični hemijski katalizatori, sve češće primenjuju u imobilisanom obliku, tj. vezuju se za pogodan čvrst nosač.

7. Primeri biokatalize u idustriji Enzimi se kao katalizatori upotrebljavaju u proizvodnji kako masovnih, tako i „finih“ hemikalija, posebno u farmaceutskoj i prehrambenoj industriji. Osim toga, oni se koriste za tretman industrijskog otpada. Ostalo: proizvodnja alkohola, stočne hrane, aditiva, primena enzima u organskoj sintezi, analitici, medicini, dijagnostici.

8. Najvažniji proizvodi dobijeni primenom enzima kao katalizatora i oblast njihove primene

9. Proizvodnja akrilamida Akrilamid je važna sirovina u proizvodnji polimera, poliakrilamida, koji se koriste u proizvodnje hartije, premaza, kao punioci i flokulacioni agensi. Hemijski postupak sinteze akrilamida podrazumeva visokotemperaturnu hidrolizu akrilonitrila u prisustvu soli bakra kao katalizatora. Glavni problem u ovom procesu je postanak značajne količine akrilne kiseline, kao sporednog proizvoda, usled dalje hidrolize akrilamida. Pored toga, akrilamid se teško odvaja i prečišćava iz reakcione smese, a nemogućnost regeneracije katalizatora rezultira stvaranjem značajne količine otpada. CH2=CH–CONH2

10. „Nitto“ Chemical Corporation je 1985. godine razvio biokatalitički postupak proizvodnje akrilamida, koji podrazumeva hidrolizu akrilonitrila u prisustvu enzima nitril-hidrataze. U procesu se koriste cele ćelija bakterije Rhodococcus rhodochorous J1 imobilisane na polipropenamidnom gelu. Dakle, i hemijski i enzimski postupak podrazumeva istu reakciju, ali se u biokatalitičkom postupku, proces izvodi pod blagim uslovima, na sobnoj temperaturi, pri pH 7,5 sa prinosom od 99,99 %. Pored toga, imobilisani katalizator se lako regeneriše i ponovo koristi.

11. Proizvodnja polimera Lipaze izolovane iz vrsta Canida antartica i Pseudomonas cepacia katalizuju polimerizaciju slobodnih hidroksi kiselina, njihovih estara i laktona (ciklični estri koji nastaju intramolekulskom esterifikacijom hidroksikiselina sa –OH grupom u položaju 4 ili dalje) u poliestre. U slučaju laktona, kao monomeri korišćeni su laktoni počev od butirolaktona do makrolidnih laktona sa šesnaestočlanim prstenom. Proces se odigrava pod blagim uslovima na temperaturi oko 60 oC i bez prisustva rastvarača. Međutim, u ovakvim uslovima stepen polimerizacije je relativno nizak, tako da masa dobijenih poliestra ne prelazi 10000. Proizvodi većih molekulskih masa dobijaju se ako se reakcija izvodi u skupim organskim rastvaračima, što ograničava komercijalnu primenu.

12. Poliestri znatno većih molekulskih masa (do 130000) dobijaju se polimerizacijom diola i dikarbonskih kiselina, ili diola i diestara dikarbonskih kiselina, katalizovanom lipazama, pri čemu se reakcija može odvijati i bez prisustva rastvarača.

13. Enzimi peroksidaze (na primer peroksidaza izolovana iz rena) u prisustvu vodonik-peroksida katalizuju polimerizaciju para-supsitutisanih fenola. Povezivanje aromatičnih prstenova odvija se u orto-položajima u odnosu na fenolnu grupu. Smatra se da najpre dolazi do oksidacije fenola u orto-difenol, koji reaguje sa vodonikom iz orto položaja sledećeg molekula oksidovanog fenola uz eliminaciju molekula vode.

14. Biokataliza u prehrambenoj industriji Proizvodnja mleka i mlečnih proizvoda koji ne sadrže laktozu, zasnovana je na dejstvu enzima β-galaktozidaze, koji hidrolizuje laktozu u sastavne monomere glukozu i galaktozu.

15. Biokataliza je nezamenjiva i pri proizvodnji visoko-fruktoznog sirupa čija godišnja produkcija prelazi 10 miliona tona. Kao polazna sirovina koristi se skrob iz krompira ili kukuruza. Kiselo katalisanom (sirćetna kiselina), enzimski katalisanom (dejstvo amilaza) ili kombinovanom (kiselo-enzimskom) hidrolizom skrob se razlaže do D-glukoze. Dejstvom enzima glukozo-izomeraze D-glukoza se prevodi u D-fruktozu. Komercijalna fruktoza se proizvodi u koncentracijama: 42%, 55% i 90%. Fruktozni sirup se široko primenjuje u prehrambenoj industriji jer je relativna slatkoća fruktoznog sirupa veća od glukoznog. Pored toga, fruktoza daje prijatan miris hrani, ne izaziva karijes zuba, i budući, da za njeno metabolisanje nije potreban insulin koristi se u proizvodima namenjem dijabetičarima.

16. Aspartam je niskokalorični veštački zaslađivač, 200 puta slađi od saharoze koji se široko primenjuje u prehrambenoj (niskokalorični napitci, sladoled, kremovi, prelivi i proizvodi za dijabetičare) i farmaceutskoj industriji. Po hemijskom sastavu aspartam je dipeptid metilestra L-aspartil-L-fenilalanina. Industrijski, aspratam se proizvodi kuplovanjem L-asparaginske kiseline sa zaštićenom amino grupom u obliku karbobenzoksi (C6H5CH2OCO-) amida sa metilestrom fenilalanina u prisustvu enzima termolizina iz bakterije Bacillus proteolicus/thermoproteolyticus. Reakcija se odvija u vodenom rastvoru, u blagim uslovima, na temperaturi 50 oC i pri pH 7-7,5.

17. Nakon sinteze dipeptida, zaštita amino grupe sa ostatka asparaginske kiseline se uklanja hidrogenizacijom. Zahvaljujući selektivnosti termolizina, sa molekula asparaginske kiseline reaguje isključivo α-karboksilna grupa, što je veoma značajno jer se izomerni dipeptid koji nastaje reakcijom β-karboksilne grupe asparaginske kiseline i amino-grupe metilestra fenilalanina karakteriše gorkim ukusom i veoma teško odvaja od željenog α-dipeptida.

18. Pored toga, enzim je potpuno stereoselektivan u odnosu na metilestar fenilalanina, pa se kao polazna sirovina može koristiti, ne samo čist L-enantiomer, već i racemska smeša. Reakcija se izvodi u višku metilestra fenilalanina, jer se u takvim uslovima aspartam sa zaštićenom amino grupom taloži, i lako odvaja iz reakcione smeše filtracijom. Višak neizreagovalog metilestra fenilalanina, koji zaostaje u filtratu po odvajanju proizvoda, se vraća u proces. S obzirom da se pri sintezi dipeptida troši samo L-enantiomer metilestra fenialanina, u slučaju kada je kao polazna sirovina upotrebljena racemska smeša, filtrat sa ostatakom neizreagovalog estra u kojem dominira D-izomer se pre vraćanja u proces podvrgava racemizaciji.

19. L-α-aminokiseline se široko primenjuju u prehrambenoj i farmaceutskoj industriji. Komercijalno, aminokiseline se proizvode različitim hemijskim i enzimskim postupcima. Međutim, hemijski postupci veoma često nisu stereoselektivni, tako da se dobija smeša aminokiselinskih enantiomera, što smanjenje prinos i poskupljuje proces. Najefikasniji način za odvajanje D i L enantiomera α-aminokiselina zasniva se na dejstvu enzima aminoacilaza. U tom cilju racemska smeša aminokiselina se prevodi u N-acetil derivat, a zatim podvrgava dejstvu enzima. Pri tome N-acetil derivat L- aminokiseline podleže hidrolizi, dok N-acetil derivat D- aminokiseline ostaje intaktan.

20. Dobijena L-aminokiselina se od N-acetil derivata D-aminokiseline odvaja jonskom izmenom ili kristalizacijom. Nakon odvajanja L-aminokiseline, preostali N-acetil derivat D-aminokiseline se podvrgava termičkoj ili enzimskoj (dejstvo enzima racemaza) racemizaciji i vraća u proces. Višestrukom racemizacijom i reciklažom neizreagovalog N-acetil derivata D-aminokiseline postiže se visok prinos.

21. Biokataliza se primenjuje i u pekarstvu. Dodaju se gljivične -amilaze, -amilaza, proteaze i glukoamilaza, čime se skraćuje vreme dizanja testa i poboljšava kvalitet proizvoda. U proizvodnji piva se koristi bakterijska -amilaza i proteaze za ošećerenje skroba neslađenog zrna, čime se povećava stepen iskorišćenja sirovina, proces proizvodnje piva je brži i dobija se bistriji i stabilniji proizvod. Takođe, biokatalizatori su nezamenjivi u proizvodnji vina i voćnih sokova. Enzimska hidroliza skroba (bakterijske -amilaze i gljivična glukoamilaza).

22. U konditorskoj industriji, u cilju sprečavanja formiranja kristala saharoze u proizvodima upotrebljava se invertaza, dok se lipaze koriste za intenziviranje arome čokoladnih proizvoda. U proizvodnji mesa i mesnih prerađevinaproteaze-ubrzavaju sazrevanje npr. haringe, morune itd., a meso je mekše i boljeg kvaliteta. U industriji mleka koriste se renin, laktaze, proteaze, lipaze, za proizvodnju sira, skraćenje procesa zrenja i poboljšanje ukusa mlečnih proizvoda.

23. Laka industrija U obradi kože upotrebljavaju se proteaze za omekšavanje površine kože i uklanjanje dlaka. Za razliku od hemijskih postupaka, na ovaj način dobija se neoštećena koža. U proizvodnji detergenata koriste se subtilizin, alkalne i metalne proteaze, lipaze, amilaze i celulaze. Primena enzima omogućava da se proces pranja efikasno odvija pri nižim temperaturama, što doprinosi znatnoj uštedi energije.

24. U tekstilnoj industriji koriste se za: Odskrobljavanje (amilaze); Biopoliranje,biokamenovanjei poboljšanjeopipatekstilnih tkanina (celulaze); Uklanjanje voskastih nečistoća (pektinaze, lipaze i celulaze); Modifikaciju poliestarskih vlakana (esteraze i lipaze); Popravljanje sjajai mekoće vunenih i svilenih tkanina (proteaze); Uklanjanje H2O2posle beljenja (katalaza). Proces obrade skraćuje se 7-10 puta.

25. Biokataliza u faramaceutskoj industriji Od otkrića antibiotskog dejstva penicilna G, ovo jedinjenje se proizvodi isključivo biokatalitički i predstavlja proizvod fermentacije bakterije Penicillium chrysogenum. 6-Aminopenicilinska kiselina koja se dobija iz penicilina G je polazna sirovina u sintezi penicilinskih antibiotika ampicilina i amoksicilina. Najefikasniji način za konverziju penicilina G u 6-aminopenicilinsku kiselinu je enzimska hidroliza u prisustvu enzima penicilin-acilaze.

26. Za razliku od hemijskog postupka, koji zahteva anhidrovane uslove i prisustvo organskog rastvarača, biotransformacija se odvija u neutralnoj sredini i na niskoj temperaturi, što onemogućava dalju transformaciju reaktivnog proizvoda.

27. Prva faza u proizvodnji kortizona i sličnih antiinflamatornih steroida iz progesterona, za kojom sledi nekoliko hemijskih koraka, je biokatalitička hidroksilacija 11-og C-atoma polaznog supstrata. Pored toga, dalja konverzija kortizona u prednizon koja podrazumeva dehidrogenizaciju u položaju 1 prstena A, takođe je enzimski kontrolisana i odvija se u prisustvu bakterije Arthobacter simplex.

28. Sinteza vitamina C (L-askorbinske kiseline) iz D-glukoze predstavlja jednostavan primer za demonstraciju značaja, prednosti i širokih mogućnosti biokatalize. Klasičan industrijski postupak za proizvodnju vitamina C iz D-glukoze podrazumeva niz stupnjeva: 1) redukciju D-glukoze u D-sorbitol u prisustvu nikla kao katalizatora; 2) selektivnu enzimsku oksidaciju hidroksilne grupe sa C-5 D-sorbitola u prisustvu Glyconobacter oxydans ili Acetobacter suboxydans pri čemu postaje L-sorboza.

29. 3) zaštitu hidroksilnih grupa sa C-2, C-3, C-4 i C-6 L-sorboze prevođenjem u acetal pomoću acetona u prisustvu sumporne kiseline; 4) oksidaciju primarne alkoholne grupe zaštićene L-sorboze u diacetonski derivat 2-keto-L-glulonske kiseline u prisustvu paladijuma kao katalizatora; 5) kiselu hidrolizu diacetala u 2-keto-L-gulonsku kiselinu i 6) konverziju 2-keto-L-glulonske kiseline u vitamin C izomerizacijom i intramolekulskom esterfikacijom (laktonizacijom).

30. Zbog primene sumporne kiseline u procesima građenja acetala i njegove hidrolize proizvodnja jedne tone vitamina C rezultira stvaranjem iste količine natrijum-sufata (aceton se reciklira). Pod dejstvom enzima genetski modifikovane bakterije Ervinia herbicola moguća je direktna konverzija D-glukoze u 2-keto-L-gulonsku kiselinu, koja zamenjuje pet faza u klasičnoj sintezi vitamina C. Pored toga, otkriveno je da se pod dejstvom enzima laktonaze iz vrste Zymomonas mobilis, 2-keto-L-gulonska kiselina prevodi u vitamin C, čime se u poslednjoj fazi sinteze izbegava upotreba metanola i mineralnih kiselina.

31. Uprkos otkriću ovih biokatalitičkih procesa, istraživanja u cilju pronalaženja efikasnog i jeftinog načina za sintezu vitamina C iz glukoze se nastavljaju. Nedavno je patentiran postupak za direktnu konverziju glukoze u vitamin C u prisustvu hidratisanog oksida kobalta (CoO2xnH2O) kao katalizatora, koji se dobija tretiranjem kobaltovih soli sa hipohlorastom kiselinom. Mehanizam ovog procesa nije razjašnjen. Proces se odvija na sobnoj temperaturi, pri pH 5,5 uz prinos vitamina C od 50 %. Sporedni proizvodi reakcije, kao što je sorboza se mogu izolovati i reciklirati.

32. Biokataliza u tretmanu organskog otpada Hemijski tretman organskog otpada podrazumeva kiselu ili baznu hidrolizu, sagorevanje pri visokim temperaturama, ili oksidaciju, koja se često odvija u prusustvu metalnih katalizatora. Biološka razgradnja organskog otpada podrazumeva ili njegovu potpunu degradaciju do ugljen-dioksida, vode i neorganskih jona, koja je označena kao biodegradacija, ili konverziju toksičnih jedinjenja u manje toksične ili netoksične proizvode koja se naziva biotransformacija. Bioremedijacija je proces u kojem nativni (autohtoni) mikroorganizmi, gljive i zelene biljke kroz svoju normalnu životnu aktivnost degraduju i detoksifikuju zagađivače opasne za zdravlje čoveka i/ili životnu sredinu.

33. Mikroorganizmi mogu oksidativno metabolisati i aromatične ugljovodonike. Smatra se da su mikrobi „ovladali“ degradacijom kompleksnih aromatičnih struktura zahvaljujući činjenici da se prirodnom evolucijom kod njih morala razviti sposobnost degradacije sveprisutnih lignina do ugljen-dioksida i vode. Najrasprostranjeniji mehanizam degradacije aromatičnih ugljovodonika podrazumeva uvođenje dve hidroksilne grupe u aromatični prsten (u orto ili para položaju) pomoću enzima oksigenaza. Nakon toga, uz učešće dioksigenaza dolazi do orto ili meta cepanja aromatičnog prstena pri čemu postaju supstituisane ili dikarbonske kiseline.

34. Drugi moguć način podrazumeva stvaranje epoksidnog intermedijera koji se u prisustvu vode pomoću enzima hidraza transformiše u diol. Diol se dalje može degradovati do nezasićene dikarbonske kiseline. Postale kiseline se lako uključuju u metaboličke puteve i razgrađuju do CO2 i H2O.

35. Fenoli i njihovi derivati su česti sastojci otpadnih voda iz industrije papira i rafinerija nafte. Imobilisane ćelije Pseudomonas putida mogu oksidovati fenolna jedinjenja u karboksilne kiseline pri koncentracijama fenola u vodama do 1,5 g/L. Pri sličnim koncentracijama fenola i pri visokoj koncentraciji soli u vodi, Candida tropicalis potpuno razlaže fenole do ugljen-dioksida i vode. Brojna fenolna jedinjenja se mogu odstraniti iz vodenih rastvora dejstvom imobilisanih izolovanih enzima lakaze i tirozinaze. Proces podrazumeva oksidaciju fenola u orto-hinon i dalju spontanu polimerizaciju hinona u nerastvorni polimer koji se lako uklanja adsorbcijom ili ceđenjem.

36. Osim mogućnosti degradacije fenola, imobilisane ćelije Pseudomonas putida, metabolišu cijanidne jone u vodenim rastvorima do CO2 i NH3, pri koncentracijama cijanida nižim od 120 mmol/L. Vrsta bakterije PseudomonasS1 razgrađuje organske nitrile, kao što su akrilonitril i adiponitril najpre do odgovarajućih kiselina, koje se dalje metabolišu do CO2 i H2O. Neke vrste mikroorganizama mogu degradovati hlorovana aromatična jedinjenja. Pošto su halogeni derivati, najčešće rezistentniji na degradaciju od svojih nehalogenovanih prekursora, glavni način remedijacije podrazumeva njihovo dehalogenovanje koje može biti hidrolitičko, reduktivno ili oksidativno. Nijedan od ova tri načina nije opšti mehanizam degradacije hlorovanih aromata.

37. Hidrolitičko dehalogenovanje koje se odvija u prisustvu bakterija vrsta Pseudomonas i Arthobacter uglavnom je uslovljeno prisustvom karboksilne grupe na aromatičnom prstenu u para položaju u odnosu na hlor. Reduktivno dehalogenovanje je takođe ograničeno na relativno mali broj supstrata. Oksidativno dehalogenovanje je najčešći mehanizam degradacije aril-hlorida, koji je zapažen ne samo na mono-, već i na diaromatičnim supstratima. Fenolna jedinjenja dobijena oksidativnim dehalogenovanjem mogu se dalje degradovati na isti način kao i fenoli.

38. Enzimi oksigenaze različitih mikroorganizama konvertuju polihlorovana aromatična jedinjenja u odgovarajuće hlorovane fenole i hinone, koji se dalje mogu razgraditi u prisustvu bakterija vrste Pseudomonas. Međutim, uzrok rezistentnosti i sveprisutnosti hlorovanih aromatičnih jedinjenja u životnoj sredini ogleda se u činjenici da enzimske transformacije ovih jedinjenja u velikom broju slučajeva ne podrazumevaju uklanjanje halogena. Tako na primer metabolička transformacija herbicida metolahlora gljivom Cunninghamella elegans rezultuje postankom nekoliko proizvoda u kojima halogena funkcija ostaje intaktna.

39. Biokatalitički procesi primenjuju se i za uklanjanje eksploziva iz zemljišta i voda. Na primer, brojni mikroorganizmi imaju sposobnost da potpuno degraduju 2,4,6,-trinitrotoluen (TNT). Mehanizmi razgradnje su različiti, ali procesi uvek započinju redukcijom nitro grupa u amino grupe ili reduktivnom dinitrifikacijom TNT-a u 2,4-dinitrotoluen. Dakle, brojni mikroorganizmi imaju sposobnost razgradnje različitih organskih jedinjenja koja su sveprisutna u industrijskom otpadu. Međutim, treba imati u vidu da je biodegradacija određenog jedinjenja ili klase jedinjenja znatno efikasnija kada su ona „sama“ nego kada se nalaze u smeši sa drugim tipovima jedinjenja, što donekle ograničava njenu primenu u tretiranju kompleksnog industrijskog otpada.

40. Biogorivaibioenergija

41.  HVALA NA PAŽNJI!