Interação entre Theobroma cacao e Crinipellis perniciosa

1. Interação entre Theobroma cacao e Crinipellis perniciosa Dr. Abelmon Gesteira DCB/UESC

2. Interaction cacao-Crinipellis • Crinipellis (Cp) • Basidiomiceto • Fase patogênica e saprofitica • Sintomas • Desenvolvimento anormal dos caules e flores • Formação de vassouras • Infecção dos frutos • Conseqüências • Econômicas • Sociais • Ambientais

3. Interação cacau-Cp: os sintomas

4. Bibliotecas de cDNA das interações compatível e incompatível • Objetivo: Monitorar comparativamente a expressão diferencial de genes resultantes interação cacau-Cp • Acessos utilizados - TSH1188 (resistente)  RT - Catongo (susceptível)  SP

5. Plantas cultivadas em casa de vegetação (Ceplac) • Inoculação e cultura controladas (mistura de esporos, spray, umidade,…) 75.000 basidiósporos/mL

6. Inoculação (30d) 0 24h, 48h, 72h 5 DAI Sintomas e pontos de coleta Plantio Catongo

7. Extração de RNA: um novo método

8. Plantio Inoculação (30d) 70 dias 0 24h, 48h, 72h Cada 5 DAI rRNA 28S rRNA 18S rRNA 5S Extração de RNA de cacau • RNA extraído dos diferentes pontos de coletas de TSH e Catongo • Pool de RNA

9. Confecção das bibliotecas Smart Creator Kit (Clontech)

10. 2. Statistical analysis of the cocoa 2. Statistical analysis of the cocoa - - Cp Cp libraries libraries Library Library Sequences Sequences Sequences Sequences Singletons Singletons Unigene Unigene Mean Mean size size Redundancy Redundancy Library specific Library specific Contribution Contribution c TC generated generated analyzed analyzed (%) (%) of of the the (%) (%) unigene (%) unigene (%) (%) (%) a a b b f f g g h h (%) (%) d d sequences sequences e e RT RT 3355 3613 3172 (88) 1520 (48) 115 199 1719 (54) 341 46 1371 (79.7) 46.8 SP SP 3790 3271 2852 (87) 1065 (37) 142 1207 (42) 354 58 859 (71.2) 29.3 6884 2585 Total Total 341 2926 347.5 52 2230 - - 6024 Vector sequences and sequences of low quality were eliminated. Vector sequences and sequences of low quality were eliminated. a a raries. The percentage was calculated as number of singletons/nu The singletons present in each library independent of other lib The singletons present in each library independent of other lib raries. The percentage was calculated as number of singletons/nu mber mber b b of sequences analyzed from the library. of sequences analyzed from the library. TC = tentative TC = tentative contig contig . The contigs present in each library independent of other libra . The contigs present in each library independent of other libra ries. ries. c c The unigene set for each library is the sum of singleton plus c The unigene set for each library is the sum of singleton plus c ontigs for the library. ontigs for the library. d d The mean size of the unigene sequences. The mean size of the unigene sequences. e e The redundancy of each library calculated as 1 The redundancy of each library calculated as 1 - - (unigene library/number of sequence analyzed). (unigene library/number of sequence analyzed). f f The The unigenes unigenes (singletons+contigs) specific to the library. The percentage wa (singletons+contigs) specific to the library. The percentage wa s calculated as (library s calculated as (library - - specific specific unigenes unigenes /unigene total). /unigene total). g g The percentage contribution of The percentage contribution of unigenes unigenes specific to each library as a percentage of total specific to each library as a percentage of total unigenes unigenes . . h h Características das bibliotecas The cocoa-Cp interaction libraries show a high library specificity (79.7 and 71.2%).

11. RT and SP libraries are represented by and , respectively. Distribuição dos ESTs por contig

12. N° de ESTs Library TC Putative function of the gene family Species Expected Size (bp) in TC (%) - 27 Arabido psis thaliana 74 41 Unknown function homologue to Orf107a 2.10 521 - 26 Betula platyphylla 9 37 Metallothionein - like protein 6.10 651 - 93 Theobroma cacao 19 32 Seed protein homolog to trypsin inhibitor 2.10 929 - 34 Oryza sativa 112 28 Pathogenesis - related protein 4b 1.10 1058 - 10 Gossypium hirsutum 184 13 Proline - rich protein 5.10 184 RT Poncirus trifoliata 76 12 Ribosomal RNA 18S 0.0 893 - 22 Oryza sativa 60 10 Unknown function 6 .10 386 - 16 Petuniaxhybrida 10 9 Metallothionein - like protein 2.10 489 - - 20 9 No hit 829 - 6 Vaccinium corymbosum 42 9 Dehydrin 2.10 618 - 26 Betula platyphylla 13 144 Metallothionein - like protein 6.10 669 - 27 Arabidopsis thaliana 42 49 Unknown function homologue to Orf107a 1.10 266 - 16 Petuniaxhybrida 20 29 Metallothionein - like protein 3.10 535 - 9 Arabidopsis thaliana 141 26 Ankyrin repeat family protein 1.10 625 - 24 Gossypium hirsutum 103 13 Metallothionein - like protein 1.10 495 - 7 SP Arabidopsis thaliana 57 10 Ankyrin repeat family protein 7.10 505 - 4 Oryza sativa 1 8 Unknown function 7.10 494 - 28 Arabidopsis thaliana 132 8 Putativ e copper chaperone 2.10 631 - 10 Mus musculus 38 6 Nuclear factor 1 1.10 447 - 8 Homo sapiens 52 6 Unknown function 1.10 497 - 4 Mus musculus 124 6 Unknown function 1.10 499 ESTs as mais abundantes

13. Comparação com outras bibliotecas de cacau Venn diagram showing the distribution of the sequences present in cacao libraries. a. From Verica et al., 2004. b. From Jones et al., 2002.

14. Outros genes de interesse • Resistência/defesa: quitinases, HPRP, proteina rica em leucina, PRs, Bax inhibidor, U-box, cistatina, glucanase • PCD/necrose: superoxide dismutase, oxalato oxidase, proteínas relacionadas a senescência, proteases, proteasoma 26S • Parede celular: expansin, celulose sintase, peroxidases • Detoxificação: transportador ABC, proteína de reparo • Hormônios: proteína regulada por auxina, proteína reprimida por auxina, • Fatores de transcrição: myb fator, WRKY, bzip • Transdução: receptor kinase, calmodulina, MAP kinase • Outros: Formato deshidrogenase, acido cafeico, glicerol aciltransferase, diacilglicerol kinase, transportador de sacarose

15. RT SP Poucas diferenças quantitativas com relação a classificação dos genes

16. Estudos funcionais de genes de interessem • Glicanase • Proteases • Factor de transcription WRKY • Bax Inhibidor (regulador de morte celular) • PR 10

17. Estudo funcional da PR10 • Clonagem em vetor de expressão (pET28a) • Expressão em bacteria pLysBl21 • Purificação da proteina em coluna His-Tag

18. Estudo funcional da PR10 • Teste de atividade anti-fungica (Cp) • Em pseudo-colonias (Freitas et al. 2005) • Com 10 ug de PR10 Controle PR10 10 ug

19. Screening da biblioteca BACColaboração com o Cirad • Estudos de promotores; • Sondas: 27 cDNA interação cacao-Cp; • Identificação de 21 clones BACs; • sub-clonagem e sequenciamento de promotores.

20. Estudos de expressão / ArraysColaboração com o Cirad • PCR de todos ESTs de cada biblioteca de cDNA • Confeção dos macroarrays (Nylon) • Hibridização com sondas Catongo e TSH • Projeto en andameto

21. Tese Defendidas • Dahyana Santos Britto. Estudos funcionais de genes que codificam proteínas PR ( Pathogenesis Related Proteins) expressas em theobroma cacoa em resposta ao ataque de crinipellis perniciosa. 2005. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz,. Orientador: Abelmon da Silva Gesteira. • Stênio Carvalho Santos. Caracterização de hidrofobinas do fungo Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer, Causador da Doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro . 2005. 53 f. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz. Orientador: Julio Cezar de Mattos Cascardo • Joci Neuby Alves Macêdo. Caracterização funcional do indutor de necrose de Crinipellis perniciosa EM Theobroma Cacao L.. 2004. 54 f. Dissertação (Mestrado em Mestrado Em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz Orientador: Julio Cezar de Mattos Cascardo

22. Tese em Andamento • Braz Tavares da Hora Junior. Determinação de genes envolvidos na resistência do cacau ao Crinipellis perniciosa via arrays. Início: 2006. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - UESC, Orientador - Fabienne Micheli • Heliana Argolo Santos Carvalho. Estudo funcional de genes envolvidos na interação cacau-Crinipellis. Início: 2005. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz. Orientador – Fabienne Micheli • Livia Santos Lima. Mapeamento de genes de resistência obtidos pela genômica da interação cacau-crinipellis, aplicados à programas de melhoramento. Início: 2005. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - UESC. Orientador Fabienne Micheli • Maiza Alves Lopes. Estudo funcional de fatores de transcrição WRKY da interação cacau-Crinipellis perniciosa. Início: 2006. Tese (Doutorado em Genetica e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz. Orientador Fabienne Micheli • Sarah Alves de Melo. Análise bioquímica e funcional do gene relacionada à patogênese (PR10) isolado de uma biblioteca de cDNA da interação entre Theobroma cacao e Crinipellis perniciosa . Início: 2006. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz Orientador - Abelmon Gesteira

23. Agradecimentos • Fapesb • UESC • CIRAD • Dr. Júlio Cascardo • Dr. Nicolas Carles e Dra. Fabienne Micheli pela a análise de bioinformática • Dra. Karina Gramacho • Aos Bolsistas Aline Clara, Lorena Blosi e Antônio Carlos Rodrigues