Enzimología

1. BIOQUÍMICA Enzimología

2. Enzimología • Generalidades. • Clasificación. • Modo de acción de las enzimas. • Cinética de las reacciones simples catalizadas por enzimas. Ecuación de Michaelis-Menten. • Actividad enzimática. Unidades. Cuantificación de la actividad enzimática. • Coenzimas. • Factores que afectan la cinética enzimática. Inhibidores enzimáticos. • Regulación de la catálisis enzimática.

3. Las enzimas son:

4. E + P [ES] E + S Las enzimas son proteínas altamente especializadas. Función: catálisis (o regulación de la velocidad) de las reacciones químicas en los seres vivos.

5. Las enzimas son proteínas* que catalizan reacciones químicas • Muchas reacciones requerirían condiciones extremas de presión, temperatura o pH sin catalizador, pero ocurren en condiciones fisiológicas con enzimas. Ej. Glc ----> CO2 + H2O en un calorímetro = Ø Las enz. aceleran a 1010a 1014veces más rápido que las reacciones no cataliza­das. Ureasa en orina = 1014 (significa que una reacción que catalizada toma 1 segundo podría tomar 3 millones de años sin estar catalizada). * En su mayoría son proteínas, hay ARN con capacidad catalítica (ribozimas)

6. Estructura de una enzima • Las proteínas enzimáticas están formadas por una gran cantidad de aminoácidos (AA), que cumplen funciones diferenciadas: • No esenciales, estructurales, de unión y catalíticas. • Los AA no esenciales pueden ser reemplazados y, en algunos casos, eliminados sin pérdida significativa en la función o conformación de una enzima. • Los AA estructurales = conforma­ción de la enzima, "forman su esqueleto". • Los AA de unión = asociación entre la enzima y el sustrato. • Los AA catalíticos = transformación del sustrato.

7. Aspectos generales de las enzimas • Las enzimas son catalizadores específicos: cada enzima cataliza un solo tipo de reacción y casi siempre actúa sobre • un único sustrato o • un grupo muy reducido de ellos. Sustrato: sustancia sobre la que actúa la enzima

8. Especificidad de función de las enzimas

9. Mecanismo de la reacción enzimática En toda reacción química se produce la transformación de una sustancia inicial, denominada sustrato (S), en una sustancia final o producto (P), según la siguiente notación:

10. Reacción catalizada por una enzima: centro activo región concreta de la enzima donde el sustrato se une E + S  ES  E + P Complejo enzima-sustrato

11. El centro activo comprende • un sitio de uniónformado por los aminoácidos que están en contacto directo con el sustrato y • un sitio catalítico, formado por los aminoácidos directamente implicados en el mecanismo de la reacción Centro activo: Es el sitio donde están los AA de unión al S y los AA que median el efecto catalítico de la enzima. (uniones intermoleculares de la enzima c/el S en una orientación tal que encajan correctamente, como las piezas en un rompecabezas).

12. El sustrato se une a la enzima luego se inicia la catálisis Sitio de unión: es el que le da la especificidad a la enzima Sitio catalítico

13. Nomenclatura Hay varias formas de nombrar una enzima: • nombres particulares • nombre sistemático • código de la comisión de enzimas (EC = EnzymeComission) de la UIB

14. Nomenclatura: nombres particulares • Antiguamente, los enzimas recibían nombres particulares, asignados por su descubridor. • Ejemplos: amilasa(hidrolisa el almidón) glucoquinasa Glc + ATP  Glc-6P + ADP • Al ir aumentando el número de enzimas conocidas, se hizo necesaria una nomenclatura sistemática que informara sobre la acción específica de cada enzima y los sustratos sobre los que actuaba.

15. Nomenclatura: nombre sistemático Consta actualmente de 3 partes: • el sustrato preferente • el tipo de reacción catalizada • terminación "asa" ejemplo: la glucoquinasa ATP:glucosafosfotransferasa Glc + ATP  Glc-6P + ADP

16. Comisión de EnzimasNomenclatura: __.__.__.__. El nombre es identificado por un código numérico: • encabezado por las letras EC (enzymecommission) • seguidas de cuatro números separados por puntos. • el primer número indica a cual de las seis clases pertenece la enzima, • el segundo se refiere a distintas subclases dentro de cada grupo, • el tercero y el cuarto se refieren a los grupos químicos específicos que intervienen en la reacción y el nº de orden en la lista.

17. Clasificación y Nomenclatura: Comisión de Enzimas Clases • Óxido-reductasas • Transferasas • Hidrolasas • Liasas • Isomerasas • Ligasas

18. Nomenclatura: Comisión de Enzimas EC 2.7.1.2. 2: transferasa 7: fosfotransferasa 1: el aceptor es un grupo OH 2: es un OH de la D-glucosa el que acepta el grupo fosfato. • Ej.: la ATP:glucosafosfotransferasa • (glucoquinasa) • Glc + ATP  Glc-6P + ADP Glucoquinasa

19. Creatinfosfo quinasa • Dímero: M (músculo) – B (cerebro) separables por electoforesis (método de estudio) • Cerebro = BB (CPK1 - rápida) • Músculo esquelético= MM (CPK3 - lenta) • Corazón = MB (CPK2 - intermedia) h. 6% de la CPK total = 10-50 UI/L a 30ºC.

20. Clasificación de enzimas CK o CPK = EC 2.7.3.2: Creatina kinasa • Clases • Subclases • Subsubclases • Orden Wiki

21. CPK o CK Fosfocreatina ATP + Creatina (Ác. Alfa-metilguanido-acético) ADP CH3 HO3P-

22. Lactato deshidrogenasa ó LDH Tetramérica c/2 subunidades distintas: H de corazón y M de músculo, que se combinan de 5 formas. • LDH1 – HHHH – Miocardio y • LDH2 – HHHM - Miocardio y GR • LDH3 - HHMM – Cerebro y riñón • LDH4 – HMMM – Hígado y Músc. Esquel. • LDH5 – MMMM – Músculo Esquelético

23. Isoenzimas de Amilasa (AMI) alfa-Amilasa ó α-amilasa, EC 3.2.1.1 (1,4-α-D-glucanglucanohidrolasa; glicogenasa) metaloenzima (dependiente de Ca). Corta enlaces glicosídicos alfa-1,4 al azar o at random. En animales es la mayor enzima digestiva y su pH óptimo es 6.7-7.0. En el Hº amilasa salivar y pancreática son alfa-amilasas. Esta forma es también hallada en plantas, hongos y bacterias (Bacillus). β-Amilasa (EC3.2.1.2 ) (1,4-α-D-glucan maltohidrolasa; glicogenasa) es también sintetizada por bacterias, hongos y plantas. Cataliza la hidrólisis del segundo enlace α-1,4 glicosídico desde el extremo no reductor, separando 2 unidades de glucosa (maltosa). Presente en semillas y granos de cereales; en muchos microorganismos que degradan el almidón extracelular. Los tejidos animales no contienen β-amilasa, pero puede estar presente en microorganismos del TD. El pH óptimo es 4.0-5.0.

24. γ-Amilasa (EC3.2.1.3 ) ó Glucan 1,4-alfa-glucosidasa ó amiloglucosidasa ó Exo-1,4-α-glucosidasa ó glucoamilasa; α-glucosidasalisosomal; 1,4-α-D-glucanglucohidrolasa. • Rompe los enlaces α(1-6) glicosídicos, como también el último enlace α(1-4)glicosídico del extremo no reductor de amilosa y amilopectina, produciendo glucosa. Esmásactiva a pH 3.

25. MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS • La acción de los catalizadores consiste en disminuir la Energía de activación • Las enzimas son catalizadores especialmente eficaces, ya que disminuyen la Ea aún más que los catalizadores inorgánicos. • Por ej, la descomposición del agua oxigenada (H2O2) puede ocurrir • sin catalizador Ea= 18 Kcal/mol • con un catalizador inorgánico (platino) Ea= 12 Kcal/mol • con una enzima específica (catalasa) Ea= 6 Kcal/mol • Así, se puede calcular que el platino acelera la reacción 20.000 veces, mientras que la catalasa la acelera 370.000 veces.

26. MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS Dos modelos sobre la forma en que el sustrato se une al centro activo del enzima: • el modelo llave-cerradura • el modelo del ajuste inducido

27. MODELO LLAVE-CERRADURA • La estructura del sustrato y la del centro activo son complementarias • Este modelo es válido en muchos casos, pero no es siempre correcto

28. MODELO DEL AJUSTE INDUCIDO • el centro activo adopta la conformación idónea sólo en presencia del sustrato. • La unión del sustrato al centro activo de la enzima desencadena un cambio conformacional que da lugar a la formación del producto.

29. Modelos de la interacción E - S

30. Cofactores - Coenzimas A veces, una enzima requiere p/su función la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catálisis: • Los cofactores. Pueden ser iones inorgánicos como el Fe++, Mg++, Mn++, Zn++ etc. Casi un tercio de las enzimas conocidos requieren cofactores. • Cuando el cofactor es una molécula orgánica se llama coenzima.

31. Cofactores - Coenzimas • Muchas de estas coenzimas se sintetizan a partir de vitaminas. • Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente a la enzima se llaman grupos prostéticos. • La forma catalíticamente activa de la enzima = holoenzima. La parte proteica de una holoenzima se llama apoenzima (inactiva), de forma que: apoenzima + grupo prostético= holoenzima

32. Coenzima: NAD+ Deriva de la Vitamina B5 (ácido nicotínico)

33. Coenzima: FAD Es grupo prostético Deriva de la Vitamina B2 (flavina) FAD forma oxidada FADH2 forma reducida

34. CINÉTICA ENZIMÁTICA • La cinética enzimáticaestudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. • La velocidad de una reacción catalizada por una enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar la enzima. • Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especificidad de la enzima.

35. CINÉTICA ENZIMÁTICA

36. CINÉTICA ENZIMÁTICA • MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN Finales del siglo XIX: estudios sistemáticos del efecto de la concentración inicial del sustrato s/la actividad enzimática. En 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Mentendesarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de las enzimas.

37. La v de una reacción catalizada por una enzima puede medirse con relativa facilidad (en muchos casos no es necesario purificar o aislar la enzima). La medida se realiza siempre en: • condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, • C/concentraciones saturantes de sustrato. • En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). • Se expresa en aparición de los productos o la desaparición de los reactivos

38. MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTENCÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA V = velocidad de la reacción catalizada por la enzima La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten es una hipérbola . La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.

39. La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parámetro cinético importante por varias razones: • KM = [S] para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. El valor de KM da idea de la afinidad de la enzima por el sustrato: • a menor KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y • a mayor KM, menor afinidad.

40. Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. Se dice que su cinética no es Michaeliana. • Esto ocurre con las enzimas alostéricas, cuya gráfica de v frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide • En la cinética sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.

41. Regulación de la actividad enzimática Como ocurre con toda proteína, la actividad de una enzima depende de factores tales como: la temperatura, el pH, las disoluciones salinas, los solventes, los activadores y los inhibidores, el tiempo de reacción.

42. Factores que afectan la cinética enzimática La actividad puede estar afectada por: pH - Temperatura - Fuerza iónica - Inhibidores

43. Efecto el pH Variaciones del pH del medio producen cambios en el estado de ionización de algunos grupos de una enzima, afectando su estructura tridimensional y su actividad. El cambio en la ionización de grupos químicos del sitio activo puede alterar el reconocimiento del sustrato o la reactividad de los AA del sitio activo. Todas las enzimas tienen dos valores límites de pH entre los cuales son efectivas, más allá se desnaturaliza y deja de actuar.

44. Efecto de la Temperatura Factor temperatura Si aumenta la temperatura, aumenta la energía cinética de las partículas y su movilidad produciéndose un aumento en el número de colisiones y la velocidad de la transformación. Si la temperatura continúa aumentando, se comienzan a romper unio­nes intermoleculares (responsables de la conformación) y, así, comienza a disminuir su actividad. Si la TºC es excesiva, la enzima se desnaturaliza perdiendo totalmente sus propiedades catalíticas.

45. Factores que afectan la cinética enzimática: INHIBIDORES • Irreversibles E + I  EI se unen fuertemente a la E y el complejo no se disocia • Reversibles E + I ⇄ EI Ciertas moléculas pueden inhibir la acción catalítica de una enzima: son los inhibidores.

46. Inhibidores Reversibles Pueden actuar de 3 modos: • ocupan temporalmente el centro activo por semejanza estructural con el S original: inhibidor competitivo • Se unen a otro sitio en la Enz y alteran su conformación espacial, impidiendo su unión al S: inhibidor no competitivo • Se unen al complejo E-S impidiendo la catálisis del sustrato: inhibidor acompetitivo

47. Inhibidores Reversiblesinhibidor competitivo

48. Inhibidores Reversiblesinhibidor no competitivo

49. Inhibidores Reversiblesinhibidor acompetitivo P S

50. Inhibidores Reversiblesinhibidor acompetitivo S I P