1 / 56

Heterológ fehérje-termelés prokarióta expressziós rendszerekben

Heterológ fehérje-termelés prokarióta expressziós rendszerekben. www.wzw.tum.de/gene-quantification/ mrna.html. Újra a vektorokról. A baktérium expressziós vektorok néhány tulajdonsága:. Indukálható promóter rendszer ; Ki-be kapcsolás Fehérje fúziós tag; Tisztítás, oldhatóság.

galeno
Download Presentation

Heterológ fehérje-termelés prokarióta expressziós rendszerekben

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Heterológ fehérje-termelés prokarióta expressziós rendszerekben

  2. www.wzw.tum.de/gene-quantification/ mrna.html

  3. Újra a vektorokról A baktérium expressziós vektorok néhány tulajdonsága: Indukálható promóter rendszer; Ki-be kapcsolás Fehérje fúziós tag; Tisztítás, oldhatóság www.qiagen.com

  4. Általános tanácsok prikarióta génexpresszióhoz Leggyakoribb hibák: 1. Intront ne felejtse el kivágni 2. Ellenőrizze az inzert orientációját 3. Fúzió frame-ben legyen 4. Nincs poszttranszlációs modifikáció = nem biztos, hogy aktív a termék

  5. Nem probléma, ha cDNS-t klónozunk Intronok www.wzw.tum.de/gene-quantification/ mrna.html

  6. Az inzert orientációja: alkalmazzon inkompatibilis ragadós végeket www.bch.bris.ac.uk/staff/ pfdg/ teaching/genes.htm

  7. Fúziós fehérjék. Ha fúziós fehérjét kíván expresszáltatni, akkor győződjön meg arról, hogy mindkettő ugyanabban a leolvasási keretben van-e www.bch.bris.ac.uk/staff/ pfdg/ teaching/genes.htm

  8. Poszttranszlációs modifikáció Golgi van az eukarióta sejtekben, a prokariótákban nincs nucleus Golgi

  9. RER = Rough endoplasmic reticulum P R O T E I N T R A N S P O R T Trans-Golgi Network perth.uwlax.edu/faculty/howard/

  10. glikozilezés – E. coli-ban mindez nincs Cis -Golgi Medial -Golgi Medial -Golgi Cis –Golgi Medial -Golgi

  11. Az expresszió hatékonysága E. coli-ban Függ a: 1. Promóter és terminátor típusa 2. mRNS affinitása a riboszómához 3. A transzgén kópiaszáma és helyzete (kromoszóma, vagy plazmid) 4. A fehérje végtermék lokalizációja a sejtben 5. A transzláció hatékonysága a gazdában 6. A fehérje termék stabilitása a gazdában Génről génre optimalizálni kell a rendszert Nincs egységes stratégia

  12. A transzkripciót befolyásoló tényezők • Promóterek(szabályozhatók is) • Prokarióta!! 2. Terminátorok Prokarióta!!

  13. Baktérium promóter Pribnow box Promoter search Open promoter complex http://www.blc.arizona.edu/marty/411/

  14. A prokarióta promóterek közötti különbség kicsi, de fontos lehet http://www.blc.arizona.edu/marty/ 411

  15. UP elemerősebbé teheti a promótert(RNS polimeráz kötődés) Core promoter FIS sites UP element UP element

  16. FIS protein = DNSkötődés és hajlítás (binding and bending) FIS helyek a baktérium promótereknél növelik az expressziót

  17. Eukarióta promóterekcsak első pillantásra hasonlítanak a prokarióta promóterekhez Minden szekvencia más, euk. promóterek nem működnek E. coli-ban http://linkage.rockefeller.edu/wli/pic/promoter.gif

  18. Prokarióta terminátorok hasznosak

  19. Egy jó transzkripciós terminátor erősen javítja a transzláció hatékonyságát Korlátozza az átírást, plazmid replikáció, stabilitás!

  20. A transzlációt befolyásoló tényezők 1. Riboszóma kötő hely (RBS) 2. Kodon használat 3. mRNS stabilitás

  21. Riboszóma-kötőhely (Ribosome binding site (RBS)) = <10 nt A gén 5’ végén a hajtű kerülendő (GC tartalom minimális legyen) A második kodon vizsgálata; Jó ha AAA – lizin (13.9% azE.coli géneknek). 15x-ös növekedés.

  22. kodon preferencia tRNS ellátottság a gazdában. Néhány gént teljesen újra kell szintetizálni.

  23. Kodon használat: E. coli ↔ember

  24. Kodon optimalizálás • Új gén kémiai szintézis • Másik gazda • Módosított gazda tRNS-ek termeltetése

  25. human HG expressziójaDictyostelium-ban(eukarióta példa, de E. coli-ban is hasonló problémák) human chorionic gonadotropin Dictyostelium–ban (AT >75%) Kodon használat %. 4-5x-ös növekedés. Érdekesség: csak az első 15-17 asvolt fontos (5’-specifikus hatás, riboszóma megáll és leesik). További optimalizálásnak gyakorlati jelentősége nem volt.

  26. KereskedelmiE. colitörzsekritka kodon génekkel

  27. RNS transzkriptum stabilitás Prokariótákban a legtöbb mRNS kis félélet-idejű Növelni, több idő a transzlációhoz Az 5’ és a 3’ szekvenciák befolyásolják az RNáz érzékenységet Kevés az információ

  28. Fehérje stabilitás • Proteáz aktivitás a sejtben 2. N-terminális aminosav szekvencia 3. Belső szekvencia motívumok növelik a proteolízis lehetőségét P prolinE glutaminsavS szerinT treonin …. PEST aminosavak mutációja….

  29. Proteáz hiányos gazda BL21, E. coli expresszió, lon (citoplazma) ompT (periplazma). Nem lehet mindet, mert proteázok kellenek a metabolizmushoz.

  30. N-terminális aminosavak hatása béta-galaktozidáz fehérje stabilitására

  31. PEST szekvencia a humán CFTR fehérjében (cystic fibrosis) P prolinE glutaminsavS szerin T treonin

  32. Idukálható baktérium promóterek Miért nem konstitutív, nagyon erős promóter? A szaporodáshoz idő kell A rekombináns (idegen) fehérje gyakran toxikus. A baktériumok a káros plazmidokat igyekeznek elveszíteni. indukció

  33. BL(DE3) indukálható rendszer és a pET vektorok (Novagen) yfg expressziója az erős promoterről pET23 • T7 RNS polimeráz gén kromoszómába integráltatva • a lac promóter és operátor szabályozása alatt 2) Laktóz analóg, IPTG, gazda termeli a T7 RNS polimerázt • 3) AzE. coligazda genomban ott a lacI (represszor) gén 4) Megbízható, pontos szabályozás, stabil gazda, szaporítás és termelés külön fázis

  34. cAMP CRP CAP = catabolite gene activator protein = CRP CRP T7 polimeráz T7 polimeráz

  35. pETBlue: a lacZgén a másik szálon Kék-fehér screening

  36. A legtöbb transzmembrán fehérje toxikus az E. coli-ra A lac rendszer alap expressziója már elég (leaky promóter, szivárog), hogy a gazda ne, vagy csak nagyon rosszul növekedjen inducer nélkül is

  37. Hogyan előzhető meg a szivárgás? lacIqéslacIsq – mutáns E.colitörzsek “quantity” és “superquantity” represszor; Rengeteg represszor, de indukálható A célfehérje mennyisége a sejtekben IPTG

  38. ARABINÓZ OPERON szigorúbb szabályozás… ara operon Arabinózizomeráz - araA - arabinóz→ ribulóz Ribulokináz- araB –ribulózt foszforilezi Ribulóz-5-foszfát epimeráz - araD – ribulóz-5-foszfát→xilulóz-5-foszfát, tovább a pentóz foszfát útvonalba.

  39. cAMP CAP L(+)Arabinóz szükséges az expresszióhoz Glükóz van (nincs cAMP) arabinóz van→ expresszió nincs Ara represszor Ara represszor Az AraC (Ara represszor) represszálja a cAMP kis koncentrációjánál a saját szintézisét ésrepresszálja az AraBAD szintézist, amíg nincs arabinóz. Ara

  40. Az arbinóz koncentrációjától függ az expresszió mértéke.

  41. Indukció drága vegyület nélkül Hőmérséklet növeléssel (ts fehérjék)

  42. Pl promótert a cI represszor szabályozza (λ fág)

  43. Hömérséklet szabályozás 28-32 ºC permisszív hőm.; Represszor stabil A célgénről nincs expresszió hőérzékeny cI 857 mutáns P 42 ºC nem-permisszivhőm.; Represszor inaktív Célgén erős expressziója Represszor szintézis TARGET GÉN

  44. Triptofán operon – jól ismert

  45. TRP operon alapú két-plazmid rendszer Nincs triptofán gén !

  46. Hova menjen megtermelt fehérje? kiválasztás (!!) E. coli nem tudja Inclusion bodies (oldhatatlan) Citoplzma (oldható) Periplazmatikus tér (oldható/oldhatatlan)

  47. Szignál szekvencia Gene III, fd fágperiplazmatikus térbe

  48. Hogyan tisztítsuk ki a fehérjénket?

More Related