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胃癌における COX-2 遺伝子の異常メチル化と ヒストンの脱アセチル化 Aberrant methylation and histone deacetylation of cyclooxygenase 2 in gastric cancer. International Journal of Cancer 2002, 97: 272-277. 内科学第一講座 菊地 剛史. 研究の背景. COX-2 遺伝子は胃癌の約 ８０％ において発現上昇が報告されており、癌化に重要な役割を果たしていると考えられる.
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胃癌におけるCOX-2遺伝子の異常メチル化と ヒストンの脱アセチル化 Aberrant methylation and histone deacetylation of cyclooxygenase 2 in gastric cancer. International Journal of Cancer 2002, 97: 272-277 内科学第一講座 菊地 剛史
研究の背景 COX-2遺伝子は胃癌の約８０％において発現上昇が報告されており、癌化に重要な役割を果たしていると考えられる NSAIDsやCOX-2選択的阻害薬により、胃癌の発生が 40 % 減少する報告もあり、細胞株においてアポトーシスの誘導がおきることから、過剰発現が発癌に関与している可能性が示唆される COX-2 発現上昇 細胞 増殖 増殖因子 発現誘導 MMP-2 活性上昇 浸潤能 獲得 PGE2 上昇 E-cadherin 発現低下 血管新生因子 発現誘導
RAS COX-2 遺伝子の発現制御機構 EGF -R p53 MAPK 転写活性化 転写抑制 COX-2 COX-2 の遺伝子発現はgrowth factor など oncogenic な signal により正に、p53 などの anti-oncogenic な signal により負に制御されている
研究の目的 COX-2遺伝子の発現制御は不明な部分が多く、その解明は発癌機序の解明につながるものとして期待される COX-2遺伝子の上流領域に位置するCpGアイランドにおける、COX-2遺伝子の発現制御と異常CpGメチル化について検討を行った メチル化による遺伝子発現抑制において関連が指摘されているヒストンの脱アセチル化について検討を加え、胃癌におけるCOX-2遺伝子のエピジェネティックな発現制御機構について明らかにする
COBRA （COmbined Bisulfite Restriction Analysis ） 法の概略 5m bisulfite& PCR Restriction& electrophoresis TCACAGAGCGG sodium bisulfite 5m GCA C TUAUAGAGCGG GTAC PCR 0% 50% 100% Methylation Afa I site TTATAGAGCGG 今回の検討で用いた COBRA 法は、DNAをBisulfiteで処理することにより、メチル化しているシトシンはシトシンのまま、メチル化していないシトシンはウラシルに変換される。Bisulfite処理したDNAをPCR後、メチル化アレルのみを切断する制限酵素で切断することにより、メチル化を定量的に検出出来る。
MKN45 MKN74 NUGC3 MKN45 MKN74 NUGC3 MKN28 MKN28 KatoIII KatoIII MKN7 MKN7 AZ521 AZ521 JRST JRST RKO RKO U U M M M （％） <1 <1 <1 <1 <1 <1 100 32 86 （％） <1 <1 <1 <1 <1 <1 100 34 86 胃癌細胞株における COX-2 遺伝子の異常メチル化 CpG Exon 1 100 bp AfaI 23+164 bp COBRA TaiI 23+50+114 bp AfaI TaiI COBRA 法により検出されたメチル化アレルを M で、非メチル化アレルを U で示している。Afa I , Tai I いずれの制限酵素処理においても、MKN28、KatoIII についてメチル化を認め、胃癌細胞株 8 株中 2 株 （ 25% ）において異常メチル化を検出した。RKO は Positive control として用いた。
A : Afa I 認識CpG T : Tai I 認識CpG Unmethylated CpG Methylated CpG 胃癌細胞株における COX-2 遺伝子の異常メチル化 Bisulfite-Sequence A A/T A A/T CpG CpG MKN 7 MKN 28 MKN 45 KATO III Bisulfite – Sequenceの結果を示す。COBRA法、Bisulfite-SSCP法によりメチル化を検出したMKN28,KatoIIIにおいて、メチル化はプロモーター領域全体に密におこっていることが明らかとなった。
胃癌細胞株における COX-2 遺伝子の発現 RT-PCR NUGC3 MKN74 MKN45 MKN28 KatoIII AZ521 MKN7 COX-2 GAPDH 異常メチル化を呈した MKN28 , KatoIII においては遺伝子の発現を認めず、メチル化と発現低下が相関することが明らかとなった。
N : Normal tissue N124 Y-16 N112 N114 N115 Y-1 T : Tumor tissue U M (%) 0 37 0 46 0 0 0 0 0 40 0 0 N N N N N N T T T T T T 胃癌手術摘出標本におけるメチル化の検出 COBRA 手術摘出標本 93例中 メチル化 11例（12％） 正常胃組織 18例中 メチル化 0例 93例中11例（12％）においてメチル化が認められる一方、正常胃組織についてはメチル化を認めなかった。
免疫染色による COX-2 遺伝子の発現の検討 正常胃粘膜 胃癌 異常メチル化（＋） 胃癌 異常メチル化（ー） 胃癌 異常メチル化（ー） 手術摘出標本 27例中 発現陽性 19例 （70%） 発現陰性 8例 （30%） 発現陰性 8例中 メチル化 6例 抗COX-2モノクローナル抗体を用いて、発現の検討を免疫染色により行った。 検討では、27例に対し行い、19例においては発現を認め、8例において発現を認めなかった 。 発現を認めなかった8例中6例はDNAの異常メチル化を認め、異常メチル化と発現低下に相関を認めた。
Chromatin Immunoprecipitation （ ChIP） クロマチン免疫沈降法の概略 Ac Ac DNA M M M M Ac Ac Immunoprecipitation by Anti-Ac histone H3 M M M M Ac Ac Ac Purify DNA Ac DNA MeCP2 PCR Acetylation + Target gene Transcription factor Ac Ac Ac Ac ヒストンの アセチル化状態 の変化 ？ ヒストン アセチル化 HDAC M M M M ヒストン 脱アセチル化 M M M M DNAメチル化によるCOX-2遺伝子発現抑制の分子機構に関して、クロマチンレベルで解析する目的で、クロマチン免疫沈降法により、ヒストンのアセチル化の状態を解析した。抗アセチル化ヒストンH3抗体を用いて免疫沈降を行って得られたDNAを用いてPCRを行い、アセチル化の程度を定量した。
半定量 PCR による胃癌細胞株における クロマチン免疫沈降法の結果 MKN45 MKN74 MKN28 3 MKN7 AZ521 JRST NUGC3 KatoIII 2.5 2 Input COX-2/GAPDH COX-2 1.5 1 COX-2 Anti Ac-H3 0.5 GAPDH 0 JRST AZ521 No Ab MKN7 COX-2 KatoIII MKN45 MKN74 MKN28 NUGC3 Expression + + + + + + + + Methylation Input は免疫沈降を行う前のDNA、No Abは免疫沈降の際に抗体を使用しない場合のコントロールとして用いた.。メチル化を認め、発現の低下を認めた MKN28 , KATOIII においてアセチル化ヒストンに付着したDNAが認めないことから、ヒストンの脱アセチル化が起きていることが明らかとなった。
COX-2 COX-2 GAPDH GAPDH 胃癌細胞株における脱メチル化剤、 ヒストン脱アセチル化阻害剤による遺伝子再発現の検討 ヒストン脱アセチル化阻害剤（TSA） 脱メチル化剤（5-Aza-dC ） MKN28 MKN28 Aza+TSA MKN45 MKN28 MKN45 Aza-dC (-) TSA 0.1 1 10 （mM ） 5-Aza-dC : 0.1mM RT-PCR により脱メチル化剤 5-Aza-dC 並びに、ヒストン脱アセチル化阻害剤 TSA 投与時における COX-2 遺伝子の再発現の検討を 行った。 異常メチル化を呈した胃癌細胞株 MKN28 に対する 5-Aza-dC の投与は濃度依存的に遺伝子の再発現を認めた。一方、TSA のみの投与では再発現を認めなかった。5-Aza-dC との組み合わせのTSA の追加投与により 5-Aza-dC 単独投与より、発現の増強が認められた。
胃癌細胞株における脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化胃癌細胞株における脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化 阻害剤によるヒストンのアセチル化の検討 MKN28 1.2 Aza+TSA 1 TSA Aza-dC MKN28 MKN45 0.8 COX-2/GAPDH 0.6 Input COX-2 0.4 Anti Ac-H3 COX-2 0.2 GAPDH 0 No Ab Aza-dC TSA COX-2 MKN45 MKN28 Aza+TSA Expression + + + + + Methylation MKN28 TSAの投与でヒストンの再アセチル化が確認されたが、5-Aza-dC投与のみでは遺伝子の再発現を認めるもののヒストンの再アセチル化は弱く、遺伝子の発現にはDNAの異常メチル化が優位に関与するものと考えられた。
ま と め 胃癌細胞株 8例中2例(25%)、胃癌症例93例中11例(12%)にCOX-2遺伝子の異常メチル化を認めた。 COX-2遺伝子の異常メチル化と遺伝子発現の抑制はよく 相関していた。 クロマチン免疫沈降法により、 COX-2の遺伝子のプロモーターがメチル化している例では、ヒストンの脱アセチル化を認めた。 以上の結果から、 COX-2遺伝子の発現調節において、 プロモーターのメチル化とヒストンアセチル化が重要であると考えられた。
M M M M M M M M M M M M M MeCP2 MeCP2 M : CH3 M M 異常メチル化とヒストン構造の変化による遺伝子発現抑制 Transcription factor Spreading of methylation Ac 異常な遺伝子のメチル化 Ac Ac Ac 遺伝子が発現している状態 脱メチル化 ヒストンのアセチル化 ヒストンの脱アセチル化 クロマチンの凝縮 M M M M 遺伝子の発現抑制 M M M M 通常遺伝子のプロモーター領域はメチル化されておらず、転写因子がアクセスしやすいようにクロマチンは開いた構造になっている。（上段）メチル化が起きると、MeCP2などのメチルCpG結合タンパクがDNAに結合し（中段右側）、ヒストン脱アセチル化酵素をリクルートする。その結果クロマチンは閉じた状態になり、遺伝子の発現は抑制される。（下段）
U U M M U U U U M M M M 胃癌における異常メチル化の発癌への関与 Methylation profile in gastric cancer CIMP in gastric cancer cell lines Gene CIMP（＋） CIMP（－） CIMP: CpG island methylator phenotype MKN28 MKN45 KatoIII MKN7 COX-2 methylated E-cad unmethylated Case p57 • Distinct methylation pattern and microsatellite instability in sporadic gastric cancer. Int J Cancer. 1999 左図に示したように、胃癌の一部はゲノムワイドなメチル化の異常が癌化に関与すると考えられる。そのような腫瘍においては、p16INK4A、E-cadherin、hMLH1 のメチル化が高頻度で認められる ( Suzuki et al, Int. J. Cancer, 1999)。右側に CIMP+ 細胞株、MKN28、Kato III およびCIMP － 細胞株 MKN7、MKN45 における各種遺伝子のメチル化検出例を示す。
COX-2 Pro-apototic gene？ Methylation E-CAD p16 メチル化阻害剤 COX-2 K-ras p53 ? COX-2阻害剤 COX-2 の発現と癌関連遺伝子異常の関連 CIMP － APC CIMP + 一部のCIMP+ 腫瘍では、COX-2 は異常メチル化により発現ぜず、 COX-2 非依存性の発癌経路をたどる。このような腫瘍にはメチル化 阻害剤が有効と考えられる.
