1 / 59

PAPÍRKROMATOGRÁFIA

PAPÍRKROMATOGRÁFIA. Állófázis: speciális szűrőpapír, illetve erre a papírra felvitt oldószer, a cellulózon megkötött víz képezi a megosztó fázist. Mozgófázis: szerves oldószerek és vizes puffer oldatok. Mintafelvitel:

gil
Download Presentation

PAPÍRKROMATOGRÁFIA

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. PAPÍRKROMATOGRÁFIA Állófázis: speciális szűrőpapír, illetve erre a papírra felvitt oldószer, a cellulózon megkötött vízképezi a megosztó fázist. Mozgófázis: szerves oldószerek és vizes puffer oldatok. Mintafelvitel: mikropipetta segítségével egy papírcsík szélén lévő jelre visszük fel, beszárítjuk, majd a papírcsík végét egész szélességében az oldószerbe merítjük.

  2. Ha a papírcsík az oldószert tartalmazó edényből lefelé lóg, az oldószer a papírcsíkon lefelé halad, leszálló kromatográfiának hívjuk. Ennek ellentétje a felszálló kromatográfia, ez esetben az oldószer csak a kapilláris erők hatására felfelé mozog. Kifejlesztés: • Az előrevándorló oldószer magával mossa a különböző sebességgel mozgó komponen-seket, amelyek így fokozatosan elkülönülnek egymástól. A futtatást akkor kell befejezni, mikor az oldószer a papírcsík végéhez közeledik. 

  3. Felszálló módszer

  4. A kapilláris jelenség egyensúlyi viszonyai Egyensúly: a görbült felület miatti nyomáscsökkenés = a folyadékoszlop hidrosztatikai nyomása.

  5. Kapilláris erő h = 2γcosθ ρgr • h = folyadék oszlop magassága (m) • γ = felületi feszültség (J/m2 vagy N/m) • θ = nedvesítés szöge, meniszkusz éle és a fal közötti szög • ρ = sűrűség (kg/m3) • g = gravitációs gyorsulás (m/s2) • r = kapilláris sugár (m)

  6. Kapilláris üvegcsőben a vízoszlop ma-gassága (levegőn, légköri nyomáson, 20 0C-on): • γ = 0.0728 J/m2 • θ = 20° • ρ = 1000 kg/m3 • g = 9.8 m/s2 Ha r = 1 cm  h = 1,4 mm r = 0,1 mm  h = 14 cm

  7. A vegyületek papírkromatográfiás azonosí-tását (kvalitatív analízis) megkönnyíti a retenciós faktor (Rf), amely a kromatográ-fiás eljárás során a vegyület által és a mozgó fázis által megtett utak hányadosa, tehát értéke 0,00 (a vegyület a start-ponton marad) és 1,00 (a vegyület a fronton fut) között változhat. RfA = a RfB = b c c c = az oldószer által megtett út • Az Rf érték nagysága egy anyagra jellemző, bár abszolút értéke sok tényezőtől függ.

  8. Oldószerek jellemzői A, Egyfázisú - vízzel korlátlanul elegyedő (metil-, etil-alkohol, aceton, piridin). B, Kétfázisú - vízzel csak korlátozottan elegyedő (butanol vízzel, vagy ecetsavval telítve). Oldószerek kiválasztásának szempontjai: Szétválasztandó anyag Rf értéke 0,10 és 0,90 között legyen. Vizsgált mintakomponens ne változzon. Megoszlási egyensúly hamar beálljon  folt alakja ne változzon a futtatás alatt. Kifejlesztés ideje 2-8 óra között legyen. Mintafelvitel: 5-20 μl mikropipettával, vagy Hamilton fecskendővel, pontszerűen a startvonalra. Beszárítás.

  9. Kifejlesztés • Kromatografáló edény: • saválló, átlátszó és zárt, általában üveg. • A kifejlesztés előtt a papírt telíteni kell az oldószer gőzeivel (kb. 20% vizet köt meg és ezzel kialakul a megosztó állófázis). • Papír behelyezése a mozgófázisba. • Futtatás, amíg 1 cm-re megközelíti az oldószer-front a papír végét. • Fontos az állandó T. • Standard oldatokat együtt futtatjuk a vizsgált mintakomponensekkel – minőségi meghatározás Rf értékek alapján.

  10. A front megjelölése után a kromatogramot előhívjuk. Ez rendszerint úgy történik, hogy a színreakciót előidéző reagensoldatot egy porlasz-tóval a papírra fújjuk. • Mennyiségi meghatározás: A, A foltokat kivágva és a komponenseket extrahálva spektrofotometriásan (elúciós módszer). B, A papíron levő foltokat „leolvashatjuk”: denzitométerrel (UV és látható fény); radiográfiásan (fotópapír, vagy Geiger-Müller számláló). • A papírkromatográfia felhasználási területe széles, használható szerves (növényi pigmentek, redukáló cukrok, aminosavak) és szervetlen anyagok (kationok, anionok) kimutatására. Legfőbb előnye az egyszerű és olcsó méréstechnika.

  11. A klorofill-a és klorofill-b szétválasztása papírkromatográfiával

  12. A klorofillok oldékonysági tulajdonságaik alapján a többi színanyagtól elkülöníthetők. A klorofill-a és klorofill-b papírkromatográfiával acetont tartalma-zó petroléterben könnyen elválasztható. A futtatás frontvonalán (a futtatószer futási magasságában) a karotinoidok sárga foltja is látható. • A klorofill-a molekula egyik metilcsoportja helyett a klorofill-b polárosabb formilcsoportot tartalmaz. A két anyag Rf értéke, színe és abszorpciós maximuma különbözik. A klorofill-a fut magasabb-ra, foltja kékeszöld, etanolos oldatának abszorpciós maximuma 660-670 nm. A klorofill-b foltja sárgás-zöld, etanolos oldatának abszorpciós maximuma 630-640 nm.

  13. Fekete, lila és zöld festékek cirkuláris futtatással

  14. Kromatográfiás állófázisok • Hordozólapra (üveglap, alumíniumlemez) felvitt: • Szilikagél (lsd. adszorpciós kromatográfia) • Aluminium-oxid   adszorpció • Kieselguhr – diatomaföld, mely a kova-moszatok páncéljából képződött, amorf kovasav. 70-95% SiO2, aluminium-, vas- alkáli- és alkáliföldfém-oxidok. • Magnézium-szilikátok - Florisil • Cellulóz (lsd. megoszlási kromatográfia, papírkromatográfia)  megoszlás

  15. Kromatográfiás állófázisok • Módosított szilikagél (lsd. nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia - HPLC): • - fordított krom. (RP-8, RP-18)  megoszlás • - normál krom. (DIOL, CN)  megoszlás • Ioncserélők (lsd. Ioncsere kromatográfia)  ioncsere CM-cellulóz, DEAE-cellulóz kémiailag kötött fázisok

  16. Kromatográfiás állófázisok • Gélkromatográfiás anyagok – méretkizárásos kromatográfia Dextrán gélek – Sephadex G (részecskeméret 10-40 μm) Poliakrilamid – BioGel P

  17. Szilikagél Kötőanyaggal Kötőanyag nélkül(H) 5-10% gipsz (G) Makropórusos 3% keményítő változatát gélszű- résre használják. Fajlagos felület: 300 – 600 m2/g Átlagos pórusátmérő: 40 – 150 Å Stabilitás: 1-8 pH

  18. Szilikagél felülete Víz molekulát adszorbeált szilanolcsoportok H H H-hídas szilanol csoportok O Szabad szilanol csoportok H H H H OH O O O O OH Si Si Si Si Si Si O O O O O O • A víz jelenléte csökkenti az elválasztás hatékonyságát.

  19. Impregnált rétegek • Ezüst-nitrát Telítetlen vegyületek kettős kötéseivel kialakított π komplexek: Cisz-transz vegyületek elválasztása. Telített, telítetlen vegyületek elválasztásának fokozása. • Borát vegyületek Vicinális hidroxil csoportokat tartalmazó vegyüle-tekkel komplex képzés. • Koffein PAH

  20. Mozgófázis • Vizes pufferek és szerves oldószerek, valamint oldószer-keverékek (lsd. eluotróp sor). • Kapilláris erők mozgatják az eluenst (lsd. papírkro-matogr.). • Kifejlesztés ideje függ: - rétegvastagság; - szorbens szemcse jellemzői (méret, alak, stb.); - kromatografáló kád légtere; - lemez térbeli helyzete; - oldószer minősége (sűrűség). • Futtatási körülmények optimálására használják a Stahl- féle PRIZMA módszert.

  21. Mintafelvitel

  22. Thin Layer Chromatography (TLC) sajátságai Állófázis Mozgó fázis 1, Egyensúlyi viszonyok Minta komponensek Gőzfázis

  23. 1, A gőztér szerepe: • A gőztér komponensei lecsapódnak a rétegre és előnedvesítik a szorbenst, az aktív adszorpciós helyeket dezaktíválják. • Az oldószer és a réteg között nem ugyanaz az egyensúly, mint az oldószer gőzök és a réteg között! Raoult törvénye alapján • A gőztér kondenzálása telített kádból gyorsabb, ez gyorsabb futtatást tesz lehetővé.

  24. TLC és HPLC • A mozgófázis frontja ( α front) „száraz” álló-fázison halad előre ↔ HPLC • A szeparálodott komponenseket nyitott lemezen kapjuk, színes anyagok közvetlenül láthatók, könnyen archiválható ↔ HPLC • Egyszerre több minta és standard futtatható (60-70 db), azonos körülmények között ↔ HPLC • Álló- és mozgófázis (UV elnyelése megengedett ↔HPLC) szelektivítása egyaránt változtatható → HPLC

  25. Elválasztási módszerek 1, Egy dimenziós • Leszálló - Sephadex géleknél, mivel itt nincs kapillarítás. • Felszálló - leggyakrabban használt, függőleges, vagy döntött réteg. • Kör 2, Sokszorozó = lépésenkénti gradiens fejlesztés 3, Két- és sok dimenziós (planar chromatography = PC) • Széleskörű 2D PC (PCxPC) • Szelektív 2D PC (PC+PC) • Kapcsolt rétegű PC (PC-PC)

  26. PCxPC

  27. PC+PC

  28. PC-PC

  29. NagyhatékonyságúVékonyréteg Kromatográfia High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC) • Finomszemcsésrétegen, rövid futási távolságra, gyors és hatékony elválasztást tesz lehetővé. Kifejlesztési távolság (cm) Kifejlesztési idő (perc)

  30. Szempontok TLC HPTLC Szorbens vastagság 0,25 mm 0,10 mm Szemcseméret 10-15 um 5-7 um Elválasztási úthossz 10-15 cm 3-7 cm Rétegméret 20x20 cm 10x10 cm Vékonyréteg Kromatográfia (TLC)ésNagyhatékonyságúVékonyréteg Kromatográfia (HPTLC) összehasonlítása Elválasztás időtartama 30-200 perc 3-20 perc

  31. Rétegkromatogramok előhívása • Fizikai módszerek: UV fényben (254 és 366 nm) saját abszorpciójuk, vagy a háttérfluoreszcencia kioltása révén (fluoreszcens kioltás) sötét foltként detektálhatók (körbe rajzolás módszere). • Minőségi jellemzés az Rf értékekkel (azonos körülmények között  ΔRf =  2%. • Mennyiségi jellemzés (direkt, vagy indirekt lsd eluciós): • Denzitometriásan (abszorbancia, fluoreszcencia); • autoradiográfiásan (radioaktív jelölés).

  32. Rétegkromatogramok előhívása • Kémiai módszerek: • speciális kémiai reakciókkal (színes termék keletkezésével); • Pl. aminosav-ninhidrin, lipid-jódgőz, szerves anyag-kénsav. • Biológiai módszerek: • speciális mikroorganizmusokkal.

  33. Növényi pigmentek TLC elválasztása Futattószer: petroléter, aceton Kieselgel 60 F254

  34. Aminosavak TLC elválasztása • A hazai kutatások eredményeként kialakított, kati-oncserélő tulajdonságú Fixion 50 x 8 vékonyréteg alkalmas az aminosavak elválasztására. • A Fixion-50 x 8 kovalensen kötött karboxilcsopor-tokat tartalmazó kationcserélő gyanta, tehát rajta az aminosavak a startponttól a kromatogram kifej-lesztéséhez használt citrát pufferben annál maga-sabbra futnak, minél inkább savas a karakterük. • Az aminosavak minőségi azonosítása a standardként használt aminosavak egyidejű futtatása után az Rf (retenciós faktor) számításával történik. Rf = minta vándorlási távolsága (cm) oldószerfront távolsága (cm)

  35. Előhívás ninhidrin reagenssel (lsd. Ioncserés kromatográfia)

  36. Cukrok elválasztása vékonyrétegkromatográfiával Szilikagél vékonyrétegen ( Kieselgel 60 F 254 5 x 10 cm-es lemez) lehetőség van egyes szénhidrátok elválasztására. Az elválasztáshoz acetonitril : víz = 87 : 15 arányú keveréke alkalmazható. A minták specifikus reagenssel, a difenil-amin-anilin-foszforsavval elő-hívva, az egyes komponensek láthatóvá tehetők. Ezzel a módszerrel kb. 15 szénhidrát elválasztására van lehetőség.

  37. dezoxiribóz • ribóz • xilóz • arabinóz • szorbóz • fruktóz futtatási irány • glükóz • galaktóz • szacharóz • maltóz • cellobióz • melibióz • raffinóz

  38. Vékonyrétegkromatográfia alkalmazása Előnyei: • Szimultán (nagyszámú > 20) minta- és standard futtatása • Gyors és olcsó, könnyen kivitelezhető • Kis mennyiségű oldószer használat HPTLC  HPLC • Álló- és mozgófázis szelektivítása egyaránt változtatható.

  39. Alkalmazási területek • Tisztaságvizsgálat (gyártásközi - gyógyszeripar) • Kémiai reakciók nyomon követése • Előtanulmány a HPLC mérésekhez • Preparatív elválasztás - 0,1-1 g anyag, sávos mintafelvitel, elúciós (indirekt) detektálás.

  40. KROMATOGRÁFIÁS FOGALMAK DEFINICIÓJA • RETENCIÓS IDŐ (tR) • Az az idő, mely a minta adagolásától az adott alkotónak a detektorban maximális koncentrációban való meg-jelenéséig eltelik. • HOLT IDŐ (t0) • Az inert eluens rendszeren való áthaladásához szükséges idő. • REDUKÁLT RETENCIÓS IDŐ (t’R) t’R = tR-t0 • RETENCIÓS TÉRFOGAT (VR) VR = tRF F = eluens térfogati áramlási sebessége (ml/min)

  41. Redukált retenciós idő t’R = tR(retenciós idő)-t0(holt idő)

  42. Elválasztás hajtóerje: μi,s # μi,m s = állófázis, m = mozgó fázis • Kváziegyensúly jellemzése: Ki = ci,sci = mimi = niMi ci,m V Ki = ni,sMiVm = kiVm ni,mMiVs Vs ki = i-edik alkotó retenciós tényezője (kapacítás faktor) Vm = mozgófázis térfogata Vs = állófázis térfogata

  43. FÁZISARÁNY (β) β = Vm Vs Ki= kiβ ki = ni,s = tR,i - t0 = t’Ri ni,m t0 t0 • Ideális elválasztás: 1 < ki < 5 • SZELEKTIVITÁSI TÉNYEZŐ (α) α = K2 = k2= t’R2 K1 k1 t’R1 α › 1,05, feltéve, hogy t’R2 > t’R1

  44. A szelektivitási tényezőt az álló- és mozgó fázis anyagi minősége, összetétele és az elválasztás hőmérséklete határozza meg elsődlegesen. Ezek változtatásának döntő befolyása van a felbontásra! A retenciós tényezőt az állófázis filmvastag-ságával tudjuk növelni (Vs!), ennek hatása azonban nem jelentős.

  45. TÁNYÉRELMÉLET • Az elválasztás akkor hatékony, ha a csúcsok szélessége nagyon kicsi → ezt jellemezzük az ELMÉLETI TÁNYÉR-SZÁMMAL: N = tR 2 = 16 tR2 σω • Minél nagyobb N, annál hatékonyabb az elválasztás N = 103 - 105 • N növelhető: - oszlophossz↑; - szemcseméret↓; - hőmérséklet↑; - belső átmérő↓; - áramlási sebesség↓↑.

  46. Gauss görbe alakú elúciós görbe tR 2σ Félérték szélesség ω = 4 σ

  47. ELMÉLETI TÁNYÉRMAGASSÁG (H) H = L = Lω 2 L = oszlophossz N 16 tRω/ tR = relatív csúcsszélesség Minél kisebb H, annál hatékonyabb az elválasztás. FELBONTÓKÉPESSÉG (Rs) Rs = tR2 - tR1 = 2 (tR2 - tR1)≥ 1,5 2 (σ2 + σ1)ω2 + ω1 Rs = √N (α-1)k 4 α (1+k)

More Related