1 / 39

MLPA ( Multiplex ligation – dependent probe amplification )

MLPA ( Multiplex ligation – dependent probe amplification ). Peter Böhm Nielsen. Generelt analyseflow. MLPA. Anvendte metoder. HRM & Sanger sekventering. Allel 1. Allel 2. Allel 1. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Allel 2.

gin
Download Presentation

MLPA ( Multiplex ligation – dependent probe amplification )

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. MLPA(Multiplexligation – dependent probeamplification) Peter Böhm Nielsen

  2. Generelt analyseflow MLPA

  3. Anvendte metoder HRM & Sanger sekventering Allel 1 Allel 2 Allel 1 MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) Allel 2

  4. Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) • MLPA er en teknik til kopitalsbestemmelse af specifikke sekvenser. Dette sker ved simultan binding af op til 45 prober, hvorefter det relative antal af bundne prober bestemmes. • Til udførelsen benyttes PCR amplifikation.

  5. MLPA Probehybridisering 1 Promoter Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2 Exon 3 2 Promoter Exon 1 Intron 1 Intron 2 Exon 3

  6. MLPA (1)MultiplexLigationdependingProbeAmplification • Denaturering • Hybridisering • Ligering • Amplifikation • Fragment-analyse

  7. SALSA MLPA prober

  8. Hybridisering • MLPA probemixblandes med denatureretgenomisk DNA. • De to sammenhørende prober hybridiserestiltilstødende target sekvenser

  9. Ligering 3. Prober ligeressammenaf en thermostabilligase.

  10. Amplifikation • Et universelt primer par benyttestilamplifikationafalleligerede prober. Hvertamplifikatfrahver probe har en uniklængde (130 - 480 bp).

  11. Separation ogkvantiteringvedkapillærelektroforese Hver top er et amplifikatfra en specifik probe . Prøvernesammanlignes med en kontrolprøve. En forskelirelativtophøjde/areal indikerer en ændringikopitalaf den gældende probes target sekvens.

  12. MLPA

  13. MLPA

  14. MLPA

  15. MLPA

  16. MLPA

  17. Normal MLPA

  18. MLPA Deletion af exon 5-7

  19. MLPA Deletion af exon 3-16

  20. MLPA Duplikation af exon 13

  21. Hvad kan dette være ?

  22. Kan dette være rigtigt ? Det er ikke sandsynligt at ovenstående er deletioner, da proberne mellem de 2 exons har korrekt amplifikationsstatus.

  23. MLPAProbehybridisering (2) Stuffer sekvens OH P ACGTACGCACCT CCTTGATTTGGAC AGTTGGAACTAAACCTGTGCATGCGTGGATTTC Gen specifikke prober Kontroller Prober forsøges designet udenfor SNP’s

  24. MLPA prober - eksempler

  25. Anvendte metoder HRM & Sanger sekventering Allel 1 Allel 2 Allel 1 MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) Allel 2

  26. Materialer og metoder CISH og FISH for HER-2 amplifikation (1)

  27. Materialer og metoder CISH og FISH for HER-2 amplifikation (2) Farshid.

  28. Materialer og metoder (Prøvemateriale (1))

  29. Materialer og metoder (Prøvemateriale (2))Hematoxylin og eosin-farvning (HE) Cancerceller kan ”fortyndes” i normale celler Hvad har det af betydning ?

  30. ResultaterNormal

  31. Resultater Amplificeret

  32. ResultaterMLPA vs. ISH

  33. Kvalitetssikring af resultatet Quantity-peaks Q-peaks: 64, 72, 76 & 82 – indikerer DNA mængde Uafhængig af ligering

  34. Kvalitetssikring af resultatet Denaturing-peaks TE TE+50mM NaCl TE+75mM NaCl D-peaks: 88, 92 & 96 – indikerer DNA kvalitet og ligerings-reaktion Afhængig af DNA &ligering D-prober er placeret tæt på CpG-island – kræver meget energi ved denatureringen

  35. Raw-data vurdering (sloping) God amplifikation Uensartet amplifikation Resultater med samme signal-niveau er bedst at sammenligne. Sloping er OK til et vist punkt, hvis normalisering kan udføres. Kan skyldes fordampning – test med 8µl vand.

  36. Rawdata vurdering

  37. ”Skuldre” Degradering af ligerede prober: Kør MLPA-analysen direkte efter fortynding i formamid

More Related