HIV 感染的实验诊断

1. HIV感染的实验诊断 白立石 北京市疾病预防控制中心 艾滋病确认中心 2008年5月

2. 一、HIV感染后的免疫和病毒学

3. HIV的基因组结构和蛋白 蛋白酶 反转录酶 整合酶 基质 衣壳 核衣壳 表面糖蛋白 跨膜糖蛋白 HIV调节基因,有6个 tat:上调mRNA,促病毒复制-启动 rev:调节病毒mRNA-开关 vif:增强出芽,释放新病毒颗粒-感染因子 nef:下调mRNA,抑病毒复制-制动 vpu:仅见于HIV-1,功能不详； vpx:仅见于HIV-2,功能不详。 HIV结构基因,有3个 env(核苷酸5781--8360)编码包膜蛋白p160、120、41等。 gag(核苷酸310--1860)编码病毒核心/衣壳蛋白p55、24、15、17； pol(核苷酸1629--4673)编码逆转录酶(RT)、p66、51、32、11等；

5. 5 days

6. 脑部：巨嗜细胞和胶质细胞 血液 淋巴系统: 胸腺 淋巴结 脾脏 肺胞巨嗜细胞 肠道：嗜铬细胞 前列腺精液 阴道黏液 骨髓 细胞积存: CD4+T 淋巴细胞 巨嗜细胞 胶质细胞 嗜铬细胞  Image from: Kahn and Walker, M.D. NEJM 1998, Volume 339:33-39July 2

7. 感染HIV后的血清学变化 Anti-gp41,120,160 HIV RNA Anti-p24,55 P24 Ag 浓度 p24Ag 检出线 感染 1周 2周 6周 12周 8－10 年 潜伏期 急性期 艾滋病期

8. HIV antibodies HIV RNA HIV p24 antigen HIV-1早期感染病毒标志物的动态观察 血浆RNA P24 前病毒 DNA HIV抗体:ELISA 窗口期 HIV抗体:WB

9. HIV感染者的三种临床转归 CD4 CD4 CD8 aHIV Virus Virus CD8 典型 8－10 y 快速 : 4-5 y : (2%) CD4 CD8 aHIV Virus 缓慢/长期不进展 : > 10 y : (2%)

10. 二、HIV酶联筛查检测方法和试剂 ※感染急性期 ，窗口期 ※检测试剂以ELISA为主，还有PA，斑点免疫胶体金和免疫层析。 ※ELISA试剂为HIV1/2型，包括M和O组，N组不包括但很少。 ※三四五代酶联试剂的差异和使用策略： 三代成熟质量稳定，窗口期20d;四代提前4－9d，质量不稳定，用于血站急性感染的检测。 ※筛查试验和确认试验的差异： 酶联试验敏感性高于确认试验，四代试剂敏感性更高，确认阴性的不一定是真阴性。

11. （一）HIV抗体ELISA检测试剂（血液） • 第三代：双抗原夹心法，可检测所有类型抗体，由于能检出IgM抗体，缩短了窗口期，有报道说较第二代产品平均可提前5天作出诊断。 • 第四代：双抗原（抗体）夹心法，将HIV P24抗体和HIV抗原同时包被，再加入待检血清，最后加入酶标记的HIV抗原和HIV P24单克隆抗体，同时检测血清中的HIV P24抗原和HIV抗体。 • 第五代：HIV抗体和P24抗原实现分别检测，真正实现早期诊断。

12. Second Generation Third Generation Fourth Generation IgG IgM

13. 各种HIV检测方法平均窗口期 方法 平均天数 第2代EIA 45 第3代EIA 22 P24抗原 16 HIV RNA 11

14. （二）、检测试剂的质量指标 灵敏度 诊断试验的灵敏度有两个不同意义： 1．代表一个试验能检测最少量被分析物（如抗体）的能力。通常可对阳性血清进行稀释以确认哪个试验更敏感。 2．指某试验检出阳性的能力（无假阴性）。一个试验有可能检出很少量的某抗体，但也可因试验中缺少适当的抗原而漏掉一些阳性样品。

15. 2．特异性 指某试验正确鉴定所有阴性的能力（无假阳性）。大部分HIV筛查试验不是100%特异，可用公式计算 真阴性 特异度= ————————  100% 真阴性+假阳性 注：公式中真阴性指试验中所能检测的真阴性数。 如100份血清，5份真阳性，95份真阴性，与参考试验比较，某试验检出6份阳性（一份假阳性），则  特异性=94/(94+1)×100%=98.9%

16. 3．试验效率 指某试验正确鉴定所有阳性和阴性的总体能力（无假阳性 或假阴性），是灵敏度和特异性的综合指标，反映了该试验的 总的效率。 真阳性+真阴性 试验效率= —————————————  100% 真阳性+假阳性+真阴性+假阴性 注: 公式中真阳性和真阴性指试验数目。 在以上例子中，检测100份血清，5份真阳性，95份真阴 性，1份假阳性，1份假阴性，因此 4+94 试验效率= ————————  100%=98% 4+1+94+1

17. 4．预测值 预测值与以上的参数不同，它描述的是考虑了被检人群 中感染的流行因素后的试验评价。 阳性预测值（PPV）：定义为在所有阳性结果人群中感染 个体所占比例。 阴性预测值（NPV）：定义为在所有阴性结果人群中未感 染个体所占比例。 真阳性 阳性预测值= ———————— 100% 真阳性+假阳性 真阴性 阴性预测值= ———————— 100% 真阴性+假阴性 注：公式中真阳性和真阴性指试验数目。

18. ⑴在感染流行率较高（5%）的人群中 1000人受检：50份真阳性（已感染），950份真阴性（未感染）， 5份假阳性（试验结果），5份假阴性（试验结果），计算 PPV=45/(45+5)×100%=90% NPV =945/(945+5)×100%=99.5% 在另一人群有相同的结果（即相同数量的假阳性和假阴性） ⑵在感染流行率较低的人群（0.7%）中 1000人受检：7份真阳性（已感染），993份真阴性（未感染）， 5份假阳性（试验结果），5份假阴性（试验结果），计算 PPV=2 /2+5=28.6% NPV =988/988+5=99.5%

19. 5．艾滋病病原诊断中的几个问题 ⑴明确不同实验方法的意义和适应范围： HIV血清学检测方法可分初筛和确证两类。HIV初筛试验 特异性不够强，有时会造成一些假阳性结果，故在初筛试 验出现阳性结果时，应再重复试验，若仍为阳性再用确证 试验（West Blot）去证实。 但一些非感染者的血液也会对某些抗原显示反应（出现的条 带不够判为阳性的标准），在正常的非感染者人群中发生比例<15%，所以如果用WB来测ELISA阴性者的血清，有些标本被视为不确定。出现不确定结果时，可能是HIV早期感染或是非特异反应，应在1-6个月后复查，并结合个体的临床表现、感染因素、WB带型等综合分析后做出结论。

20. ⑵针对HIV感染不同时期选用不同的检测手段：HIV感染后两周内，无法查到抗体。两周后出现病毒血症，可用P24抗原检测方法或测逆转录酶活性。6-8周后抗体产生时，进行抗体检测。⑵针对HIV感染不同时期选用不同的检测手段：HIV感染后两周内，无法查到抗体。两周后出现病毒血症，可用P24抗原检测方法或测逆转录酶活性。6-8周后抗体产生时，进行抗体检测。 诊断HIV感染在早期可检测抗原，而在感染后的大多数时间，可用血清学方法诊断。

21. ⑶ HIV抗体测定的预测值：试剂的敏感性和特异性可衡量优劣，但不能完全决定一个测定结果正确与否的可能性大小，与预测值关系更大。 預測值除与试剂好坏有关外，还取决于测定对象本身患病率的高低。由表1可以看出：在用ELISA法对高危人群检测时，其阳性预测值为99.98%，而在非高危人群中，阳性预测值仅为18.94%（即查出阳性结果是真阳性的机率只有18.94%），反之阴性结果的机率为99.997%。

22. 表1 ELISA法HIV1抗体测定的预示值

23. ⑷ HIV抗体检测反应强度与HIV感染的概率：ELISA法可根据光密度（OD）值的强度直接确定。反应越强的血清，含有HIV抗体的可能性就越大。表2中正常献血员（感染率30/10万），中等强度反应时，HIV抗体阳性概率仅为1%，高强度反应时，则为86.1%。见表2。 不仅要看阴阳结果，还要看反应强度或S/CO比值。

24. 表2 HIV感染机率与ELISA反应强度的关系

25. 注： 1、数字表示相应强度反应的血清中含有HIV抗体的概率 2、低度为S/CO<1,中度为1<S/CO<6, 高度为S/CO>6。

26. 三、确认试验 • WB为主，还有：线性免疫试验（LIA）,放射免疫沉淀试验（RIPA）和免疫荧光试验（IFA）。 • WB存有培养病毒的宿主细胞成分，容易出现非特异性反应造成不确定结果，LIA使用重组蛋白（多肽），非特异性大大减少，试剂盒有INNO-LIA,Pepti-Lav等。IFA很少使用。

27. （一）、HIV抗体强度与抗体带型的关系

28. （二）、HIV病毒载量与抗体带型的关系

29. 1.实验室操作中，阴性样本被污染或洗涤不彻底。1.实验室操作中，阴性样本被污染或洗涤不彻底。 2.HIV感染急性期，窗口期附近，仅显示gp160或120，或P24，P31，P55带；此时ELISA往往已显示阳性反应 3.晚期AIDS病人，部分抗体如P24，P31丢失 4.其他病毒感染的交叉反应，如风疹，麻疹，腮腺炎等 5.自身免疫病，高丙种球蛋白血症（全身性红斑狼疮） 6.肾衰竭和血透析 7.遗传性胰腺囊肿 8.多次怀孕或输血 9. 肝病 10.乙肝、狂犬等疫苗注射，使用胸腺肽。 11.线粒体核酸和T细胞白细胞抗原引起的抗体 （三）、造成WB假阳性或不确定的原因

30. （四）WB不确定结果的有关数据 • 在无高危行为的献血和孕妇人群中， WB不确定率10-15%，甚至高达32％. Gag蛋白抗体条带最常见。 • ELISA筛查阳性结果中，WB不确定占4-20%,俄罗斯报告占12.7%。 • 我国，125份确认为HIV-1抗体阳性;条带出现百分率为：gp160、p24为100%,gp120、gp41、p66、p51和p31在96%以上, p17、p55分别为86.4%和85.6%. • 上海，36例WB试验 gp120和 p24双阳性者的跟踪随访和核酸辅助诊断发现，至少24例可判定为HIV-1感染。5例样本的核酸测定结果与血清学随访检测结果的符合率达到100%。25例随访到的对象中，18例样本平均17 天后条带有明显进展，可以判定为HIV抗体阳转 。

31. （五）假阴性结果 • 指EIA+WB的假阴性 • 原因 • 急性感染后的抗体迟反应 • 不同HIV毒株型 • 发病晚期抗体消失 • 窗口期：几周到6个月，与当地HIV流行率有关 • HIV亚型，M/N/O组间差异

32. （六）、确认试验不确定标本的常规处理 • 按照《全国艾滋病检测技术规范（2004年版）》的要求，只能作“3个月后复检”的处理，三个月后复检1次，连续2次，共6个月。 • 其转归有两种可能：仍呈现不确定或阴性，则诊断为HIV抗体阴性；带型发生进展，符合HIV抗体阳性判断标准，则诊断为HIV抗体阳性。后者是真正的窗口期感染者（一般为2-3个月，最长6个月），只占很小的比例；大多数为非感染者，但由于WB反应的敏感性而出现条带。 • 如有必要，可用辅助诊断方法对不确定样本进行实验诊断。

33. 确认结果不确定标本的辅助诊断 1、病毒载量：RT-PCR,NASBA,b-DNA，高拷贝的结果提示感染。小于18个月婴儿在10000拷贝/毫升应做HIV感染处理。注意不同方法间结果的差异，阴性不排除感染。 2、免疫标志物：CD4/CD8, CTL,微球蛋白和Neopterin等。CD4计数常用，CD4/CD8小于1提示感染。 3、核酸定性：DNA－PCR或 RT-PCR，阳性不能单独用于感染的诊断，阴性不排除感染。 4、P24抗原检测：阳性结果需经中和实验确认，才提示HIV感染。阴性不排除感染，因敏感性低：30－80％。 5、病毒分离：特异性好，但敏感性不高，潜伏期难分离 6、流行病学调查和临床症状：近期是否有HIV高危行为，是否有急性期的相关症状。

34. 四、HIV感染的早期（窗口期）诊断 1、 早期诊断的意义 　　通常窗口期急性感染时出现病毒血症，此期间病毒载量，P24抗原均很高，是HIV快速复制阶段，具有高感染力；以下情况下，非常有必要尽快开展HIV感染早期诊断： 　（1）安全用血-窗口期血液筛查； 　（2）个体需求-暴露后诊断，包括通过输血、静脉吸毒、针刺等的血液暴露，以及同性恋、异性恋等性途径暴露； 　（3）各种职业暴露后的风险评估，医生警察。

35. 2、早期感染的诊断方法 抗原检测 P24抗原EIA试剂试剂盒在血清抗体阳转前2-18天即可以检测到。第四代HIV ELISA试剂敏感性和特异性均有了很大提高，可以作为血源筛查； 病毒RNA定性与定量检测 　　第一次病毒血症高峰时间大约在感染后4-11天，可以用核酸检测进行辅助诊断。 应用辅助诊断时方法时，应综合考虑流行病史、核酸检测值、临床表现、其他检测（病毒分离，CD4细胞，抗原）等。