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HE 技术操作规范

HE 技术操作规范. 广医附一院 病理科. 第一步：固定. 固定能防止组织自溶及腐败，尽量保持组织原貌 固定液通过以下机制稳定蛋白： 相互交联：甲醛与蛋白质交联 蛋白沉淀：蛋白变性沉淀 合理固定很重要，为了： 防止组织在处理中受损 经处理组织能易于切片. 固定不当的后果. 固定不当会导致手工及自动 IHC 及 ISH 检测结果出现片状或不正常染色，从而影响免疫组化检测结果判定 固定不全过程 交联过程发生较慢，很易逆转 若固定时间过短，会发生交联不全，组织将被下一步的乙醇固定 经乙醇沉淀的蛋白其抗原结构会改变，因而不适用于 IHC 及 ISH 检测.

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Presentation Transcript

  1. HE技术操作规范 广医附一院 病理科

  2. 第一步：固定 • 固定能防止组织自溶及腐败，尽量保持组织原貌 • 固定液通过以下机制稳定蛋白： • 相互交联：甲醛与蛋白质交联 • 蛋白沉淀：蛋白变性沉淀 • 合理固定很重要，为了： • 防止组织在处理中受损 • 经处理组织能易于切片

  3. 固定不当的后果 • 固定不当会导致手工及自动IHC及ISH检测结果出现片状或不正常染色，从而影响免疫组化检测结果判定 • 固定不全过程 • 交联过程发生较慢，很易逆转 • 若固定时间过短，会发生交联不全，组织将被下一步的乙醇固定 • 经乙醇沉淀的蛋白其抗原结构会改变，因而不适用于IHC及ISH检测

  4. 固定过度 • 固定时间过长可能导致假阴性检测结果 • 过度多聚化阻止了抗原暴露，因而影响抗原修复

  5. 影响固定的因素 • 组织类型 • 从标本手术切除至开始固定的时间 • 待检标本的体积及厚度 • 固定液类型（10%福尔马林） • 固定液与组织体积比（至少10：1） • 固定的时间 • 温度

  6. 从标本离体到开始固定的时间 • 为防止组织自溶，待检组织从手术离体至开始固定之间的时间应尽可能短 • 乳腺癌最多1小时 • 胃癌应控制在20–30 分钟内

  7. 固定液种类 • 推荐10%中性缓冲福尔马林（NBF）作为乳腺癌及胃癌组织的固定液（IHC或ISH） • 10% NBF等同于4%甲醛溶液 • 交联简单的固定液 • 应使用新鲜福尔马林溶液，福尔马林贮备液应： • 定期更换 （最多贮存6个月） • 室温贮存 • 标记生产日期或稀释浓度以及过期日期固定不当会导致手工及自动IHC及ISH检测结果出现片状或不正常染色，从而影响免疫组化检测结果判定

  8. 固定时间 • 乳腺组织 • 用于HER2检测的手术切除组织样本(IHC或ISH检测)，一般固定6–48小时 • 胃组织 • 手术切除及活检组织样本，一般固定8–48小时 • 固定时间取决于待检组织类型--组织取样手段，组织厚度及固定液 • 不同的检测程序应使用优化的相应固定时间

  9. 第二步取材 • 组织块的面积通常为2.0cmX1.5cm，厚度不超过3.0mm。太大太厚的组织块常会固定不充分，而影响脱水和制片。

  10. 第三步：脱水 • 目的：因为石蜡不溶于水，所以需从组织中除去水分 • 梯度脱水：75%，85%、95%，100%乙醇 • 若无乙醇，其他溶剂例如异丙醇亦可用于脱水

  11. 第四步：透明 • 因乙醇和石蜡不相溶，所以需用另外一种溶剂 • 用于透明的溶剂既能同乙醇混溶，又能与石蜡混溶 • 常用透明剂包括： • 二甲苯 • L－苧烯 • 氯仿 • 松节油（TO） • 使用“透明”该词是因组织会变为透明

  12. 第五步：浸蜡 • 浸蜡过程中，液体石蜡代替透明液以利于进行超薄切片 • 推荐使用溶点为56–58oC的新鲜石蜡 • 应避免浸蜡时间过长 • 经合理石蜡包埋的乳腺及胃组织在进行切片之前，可在室温下(20–25oC)无限期地贮存

  13. 组织处理仪 • 影响组织处理的因素 • 热 • 增加浸润速率 • 真空 • 有助去除: • 残余空气 • 之前溶剂 • 压力 • 起搅拌作用

  14. 第六步石蜡包埋 • 将需要切片的面靠近包埋盒 • 小组织尽量聚集在一起 • 注意管腔、皮肤等组织的位置

  15. 第七步切片 • 切片机的种类 直推式 轮转式 • 切片的方式 干切 湿切

  16. 切片厚度会影响显色及检测数据分析 • 组织切片厚度标准 3–5 μm.可用经校准过的超薄切片机切片 • 切片需贴在粘合性强的载玻片上 (可使用经多赖氨酸防脱片处理的玻片)，贴片后将载玻片置于室温下风干12-24小时或于60℃烘干1小时 • 经多赖氨酸防脱片处理的玻片 • 厂商试剂盒及/或自动化染色平台需配合指定玻片使用

  17. 最好在HER2免疫组织化学染色检测前才开始切片最好在HER2免疫组织化学染色检测前才开始切片 • 如果过早切片，让切片暴露在室温太久，容易造成组织细胞抗原性受损 • 应尽可能在切片后两星期内进行染色 • 切片最长保存期为4-6星期 • 切片应从以下细胞组织区域提取 • 乳腺内的侵袭性癌细胞组织 • 食管及胃交界癌的代表性癌细胞组织 • 例如混合癌中的胃腺癌组织区域及非坏死或无感染区域

  18. 第八步捞片 • 用玻片从冷水盆上捞起蜡片，后把蜡片放在50℃上清水上展平并捞起切片

  19. 第九步烤片 • 常用温度60-70℃ • 烤片时间：最少30分钟 57 ℃过夜 • 温度过高、时间过长会导致蛋白变性 • 温度过低、时间过短烤片不充分、石蜡不溶，拖拉不彻底

  20. 第十步脱蜡至水 • 用二甲苯(或二甲苯代替品)为石蜡切片脱蜡，再用无水乙醇梯度稀释液回水 • 石蜡必须彻底清除，否则将影响染色，减低特异性染色及提高非特异性背景染色

  21. 步骤 取一黏有石蜡切片的载玻片，在室温下依序作以下操作： • 放在二甲苯I中浸泡10分钟 • 放在二甲苯II中浸泡10分钟 • 放在100%乙醇中浸泡两次，每次30秒 • 放在95% 乙醇中浸泡两次，每次30秒 • 放在80%乙醇中浸泡一次，每次30秒 • 放在75%乙醇中浸泡一次，每次30秒 • 蒸馏水洗 • 在纸巾上轻敲载玻片沥干多余的缓冲液，用吸水纸抺干组织周围

  22. 第十一步：HE染色（苏木素-伊红染色） • 原理 利用细胞内外的酸碱度与苏木素、伊红进行化学反应；即细胞核（酸性）与碱性苏木素进行反应形成蓝色；细胞质（碱性）与酸性伊红进行反应形成红色。

  23. 步骤 • 二甲苯I、II各10min • 100%酒精I、II，95%酒精I、II，80%酒精，蒸馏水各1min。 • 苏木精染液15min，流水冲洗1.5min。 • 0.5%盐酸酒精分化5s，流水冲洗1min。 • 饱和碳酸锂水溶液1min，流水冲洗10min。 • 1%伊红染液染40s，水洗 。 • 80%酒精，95%酒精I、II，80%酒精，100%酒精I、II。 • 二甲苯I、II各1min 。

  24. 第十二步：封片 • 封片剂：中性树胶、甘油等 重要提示 • 注意在任何情况下都不能让组织干透 • 尽量减少封片液用量

  25. 染片结果 • 细胞核成蓝色 • 细胞质成红色 • 红蓝对比清晰、切片完整、没刀痕皱褶等

  26. HE染色的关键 • 固定 • 脱蜡 • 染色：苏木素染色时间 0.5%的盐酸酒精分化 伊红染色 脱水情况等

  27. 感谢大家的聆听！

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