Amplificazione genica: i sistemi commerciali

1. Amplificazione genica: i sistemi commerciali Dr. Claudio Piersimoni Gruppo di Lavoro Micobatteri AMCLI Firenze, 19-22 gennaio 2009

2. Parleremo di: • Definizioni e caratteristiche • Indicazioni per l’uso • Performance analitiche • Impatto clinico • Costo-efficacia • Come implementare gli attuali sistemi • Controllo di qualità

3. I test di amplificazione diretta (DAT) • consentono il simultaneo rilevamento ed identificazione del Myc. tuberculosis complex direttamente dai campioni clinici. • i risultati sono disponibili nel giro di poche ore • non possono sostituire, ma affiancano i metodi convenzionali.

4. I sistemi commerciali (1)

5. La PCR real-time • La PCR real-time (qRT-PCR) presenta indiscutibili vantaggi rispetto alla cnPCR: • Rapidità • Ampio range di quantificazione del target • Riduzione della contaminazione da amplicons • Alta sensibilità intesa come più basso limite di detection

6. I sistemi commerciali (2)

7. Parleremo di: • Definizioni e caratteristiche • Indicazioni per l’uso • Performance analitiche • Impatto clinico • Costo-efficacia • Come implementare gli attuali sistemi • Controllo di qualità

8. Uso autorizzato (FDA) • Campioni respiratori • Contemporanea esecuzione di microscopia e coltura • Raccolti da pazienti non trattati • Microscopia positiva per BAAR • Amplicor ed E-MTD • Microscopia negativa per BAAR • esclusivamente E-MTD

9. Algoritmo 1 MMWR 2000; 49: 593-594

10. Algoritmo 2 MMWR 2000; 49: 593-594 clinicaljudgment

11. Uso accessorio • Campioni extrarespiratori • Risultati più affidabili con: • Microscopia positiva • Aspirati gastrici, pus, biopsie • Risultati meno affidabili con: • Microscopia negativa • Liquor o altri liquidi sierosi

12. Uso accessorio • Diagnosi di TB in pazienti trattati su base clinica che presentino: • esame microscopico positivo • esame microscopico e/o colturale negativi • Identificazione di Myc. tuberculosis complex in colture inquinate • Ricovero in isolamento respiratorio per pazienti con sospetta TB polmonare (single first-sputum)

13. DAT ed isolamento respiratorio Am.J.Respir.Crit.Care Med. 2008; 178: 300-305

14. Modalità d’uso • Impiego mirato sulla base di un congruosospetto clinico • clinical skills are uneven entities • di norma sul primo di tre campioni • La resa diagnostica del test dipende in larga misura da: • qualità del campione • appropriatezza della sede di prelievo

15. Selezione dei pazienti • Indicatori predittivi di PTB • Immigrazione • Infezione da HIV • Dimagrimento • Sudorazioni notturne • Lesioni polmonari • cavitarie • in sede apicale

16. Selezione dei pazienti Van den Wijngaert et al. JCM 2004; 42: 837-838 *; Cobas Amplicor Roche

17. Tempi di refertazione Am.J.Respir.Crit.Care Med.2005; 172: 1169-1227

18. Parleremo di: • Definizioni e caratteristiche • Indicazioni per l’uso • Performance analitiche • Impatto clinico • Costo-efficacia • Come implementare gli attuali sistemi • Controllo di qualità

19. I dati della letteratura • i vizi [bias] metodologici inficiano la attendibilità dei dati della letteratura • i più comuni bias possono alterare: • accuratezza • specificità

20. Parametri metodologici JCM 2003; 41: 3233-3240 • Studio prospettico eseguito in cieco • Golden standard microbiologico e clinico • Esclusione dei campioni raccolti da pazienti in terapia • Valutazione separata dei campioni respiratori ed extrapolmonari • Valutazione di 3 campioni a pz. per minimizzare la “uneven distribution” dei micobatteri nel campione • Sensibilità e specificità calcolate per pz., non esclusivamente per campione

21. Le metanalisi (campioni respiratori) Thorax 2006; 61: 783-790

22. Le metanalisi (liquor) Lancet ID 2003; 3: 633-643

23. Parleremo di: • Definizioni e caratteristiche • Indicazioni per l’uso • Performance analitiche • Impatto clinico • Costo-efficacia • Come implementare gli attuali sistemi • Controllo di qualità

24. Impatto clinico dei DAT

25. BD Probetec ET J. Infect. 2005; 50: 187-192

26. Impatto clinico dei DAT E-MTD Catanzaro et al. JAMA 2000; 283: 639-645

27. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2005; 53: 195-200 Abbott LCx

28. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2005; 53: 195-200 Abbott LCx

29. “Peso” nella decisione terapeutica Am. J. Respir. Crit. Care Med.1997; 155: 1497-98

30. Parleremo di: • Definizioni e caratteristiche • Indicazioni per l’uso • Performance analitiche • Impatto clinico • Costo-efficacia • Come implementare gli attuali sistemi • Controllo di qualità

31. Costo-efficacia • I test diagnostici a costo mediamente elevato possono ridurre la spesa sanitaria se: • Aumentano la accuratezza diagnostica • Riducono i tempi di degenza

32. Dipende da: No./anno di campioni microscopico-positivi Prevalenza di TB nei campioni microscopico-positivi Costo giornaliero dell’isolamento respiratorio Si incrementa in caso di: Alta prevalenza di MNT Esecuzione dei DAT presso laboratori regionali di riferimento Costo-efficacia dei DAT

33. Strategie di utilizzo dei DAT JCM 2008; 46: 3811-3812 E-MTD

34. Parleremo di: • Definizioni e caratteristiche • Indicazioni per l’uso • Performance analitiche • Impatto clinico • Costo-efficacia • Come implementare gli attuali sistemi • Controllo di qualità

35. Problemi sul tappeto • Falsi negativi • Diluizione del pellet • Presenza di inibitori • Controllo interno di amplificazione (CIA) • Insufficiente estrazione del target • Falsi positivi • Contaminazioni crociate • Selezione dei pazienti • Qual’è il gold standard ? • Quali micobatteri si evidenziano ?

36. Caratteristiche del CIA JCM 2004; 42: 1863-1868 • Acido nucleico • DNA plasmidico • Siti di legame dei primers • i medesimi del target • Amplicons derivati dal CIA • Differenziabili da quelli del target

37. Lysis Elution buffer Glass fiber Extraction Adsorption Phenol chloroform Precipitation Elution Ethanol Estrazione: metodi a confronto

38. Sistemi commerciali di estrazione Clin. Microbiol. Rev. 2006; 19: 165-256

39. Modifiche dei kit commerciali

40. Modifiche dei kit commerciali JCM 2004; 42: 5341-5344 [..]test confermati positivi dopo ripetizione (fra 30.000 e 499.000 RLUs).

41. Modifiche dei kit commerciali JCM 2009; 47: 282-283 st-DTB = ProbeTec (estrazione per lisi) me-DTB = ProbeTec (estrazione per lisi + cattura [NucliSens])

42. Parleremo di: • Definizioni e caratteristiche • Indicazioni per l’uso • Performance analitiche • Impatto clinico • Costo-efficacia • Come implementare gli attuali sistemi • Controllo di qualità

43. Considerazioni generali • Competenza in micobatteriologia (utilizzo per disciplina, non per tecnica) • Idoneità delle strutture • Addestramento del personale • Partecipazione a programmi di “proficiency”

44. Valutazione esterna di qualità Noordhoek et al. CMI 2004;10: 295-301

45. Valutazione esterna di qualità Noordhoek et al. CMI 2004;10: 295-301

46. I commenti degli Autori • I risultati sembrano essere influenzati più dalla tipologia degli utilizzatori che dalle caratteristiche dei metodi • Solo il 61.2% dei campioni microscopico-negativi sono stati risposti come positivi • E’ stata riscontrata una percentuale del 4.3% di falsi positivi

47. Valutazione esterna di qualità (QCMD)

48. Valutazione esterna di qualità (QCMD)

49. Valutazione esterna di qualità Dati INSTAND

50. Conclusioni • Dato l’attuale costo dei DAT commerciali, è indispensabile privilegiare la appropriatezza • Utilizzo in base al sospetto clinico • Selezionando il sito più appropriato per il prelievo dei campioni da testare • Facendo attenzione alla qualità dei campioni • La sensibilità nei campioni “smear-negative” è ancora insoddisfacente • Evitare il più possibile l’uso al di fuori della indicazioni della letteratura